發(fā)布時間：2020-07-24 20:16

【摘要】：多發(fā)性骨骺發(fā)育不良(multiple epiphyseal dysplasia;MED),是一種罕見的遺傳性骨病,患者以身材矮小和早發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎為主要特征。目前發(fā)現(xiàn),至少有六種不同基因的突變會導致MED的發(fā)生,孟德爾遺傳方式既有常染色體顯性遺傳也有常染色體隱性遺傳,而COMP基因突變是導致顯性MED發(fā)生的其中一種基因。COMP基因編碼的軟骨寡聚物基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein)是一種分泌型蛋白,主要在軟骨細胞的周圍基質(zhì)中表達,以維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。COMP單堿基突變導致骨骼發(fā)育不良的機制至今仍然不是完全清楚。相關(guān)文獻研究發(fā)現(xiàn)COMP蛋白在T3結(jié)構(gòu)域突變使蛋白錯誤折疊,導致在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)。本研究為了進一步研究COMP基因突變導致多發(fā)性骨骺發(fā)育不良的分子機制,建立了COMP突變的細胞模型,并進行了相關(guān)藥物的篩選研究。1.我們從一個患有MED的四代家系中,采集患者全血樣本,經(jīng)二代測序分析和一代測序驗證,確定了一個COMP基因突變,該突變位于11號外顯子上即c.1201GA(p.D401N)。2.為了進一步研究COMP基因突變致病的分子機制,我們在細胞水平上進行了一系列的研究,同時構(gòu)建了已報道過的COMP~(D472Y)和COMP~(T585M)。在HeLa細胞中瞬時轉(zhuǎn)染COMP野生型質(zhì)粒和COMP突變型質(zhì)粒,通過免疫熒光和免疫印跡,發(fā)現(xiàn)與野生型正常分泌的COMP蛋白相比,突變型COMP蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,影響了蛋白的正常分泌,同時發(fā)現(xiàn)突變的COMP蛋白與COMP~(D472Y)蛋白的滯留和分泌情況一致,而COMP~(T585M)蛋白滯留和分泌較少,可能是因為COMP~(D472Y)與我們的突變都發(fā)生在COMP蛋白的T3重復結(jié)構(gòu)域,而COMP~(T585M)發(fā)生在COMP蛋白的C-末端球狀結(jié)構(gòu)域。為了更加明確COMP基因突變對細胞的影響,我們構(gòu)建了慢病毒系統(tǒng),轉(zhuǎn)導HeLa細胞,篩選到穩(wěn)定表達野生型和突變型COMP蛋白的細胞模型,利用免疫印跡和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞與之前瞬時轉(zhuǎn)染的細胞現(xiàn)象一致,突變的COMP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上積累,不能正常分泌。通過實時熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)COMP突變型細胞較COMP野生型細胞相比,COMP基因在轉(zhuǎn)錄水平上無差異,說明突變型細胞中COMP蛋白的滯留主要是由于蛋白的翻譯后水平發(fā)生了改變。3.突變型COMP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上積累引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生異常,這可能與疾病的發(fā)生有很高關(guān)聯(lián)性,利用相關(guān)藥物減少突變型COMP蛋白的積累,有助于恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能,而且對于疾病的治療有一定的參考價值。通過對相關(guān)文獻研究考證,抗氧化劑乙酰水楊酸和白藜蘆醇能夠緩解突變COMP的滯留,我們利用這兩種藥物作用于建立的細胞模型,研究發(fā)現(xiàn),在突變細胞系中,75 mM的乙酰水楊酸和100μM的白藜蘆醇作用24 h,使突變細胞中滯留COMP減少。綜上所述,本研究建立的COMP突變的細胞模型證實了突變型COMP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生滯留,且蛋白分泌受損,但是COMP基因的表達水平并沒有發(fā)生變化,證明了蛋白的滯留可能是由于蛋白的錯誤折疊。此外,通過藥物篩選實驗證明了乙酰水楊酸和白藜蘆醇對突變型細胞具有一定的療效作用。本研究的數(shù)據(jù)為臨床上診斷MED以及用藥提供依據(jù),具有一定的理論意義和應用價值。
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681
【圖文】：

圖 2.1 先證者的臨床特征及 MED 家系圖譜A）先證者右手和左手的 X-ray 檢查圖像，X-ray 檢查結(jié)果顯示兩側(cè)指骨短而小，遠端橈尺骨骨骺明顯不規(guī)則分布。（B）正方形指男性，圓形指女性，黑色標識是患病者，箭頭指先證者。Fig. 2.1 Clinical findings and Family pedigree of MED.ight hand and left hand X-ray of the proband, X-ray examination showed bilateral short and small

圖 2.2 COMP 基因測序分析以及突變位點在 III 型類鈣調(diào)蛋白重復區(qū)的定位（A）COMP 基因雜合突變在 III-8、III-12 以及 II-5 的患者中被檢出，IV-9 的健康人未發(fā)現(xiàn)此突變。（B）COMP 單體的結(jié)構(gòu)圖。N-末端結(jié)構(gòu)域（NH2），II 型類表皮生長因子重復結(jié)構(gòu)域，III 型類鈣調(diào)蛋白重復結(jié)構(gòu)域，C-末端結(jié)構(gòu)域（COOH）。Fig. 2.2 Sequencing analysis of COMP gene and location of the COMP mutation with thecalmodulin-like repeat domain of COMP.(A) COMP gene heterogenous c.1201C>T (minus strand) was detected in patient lll-12, lll-8, ll-5whilst this mutation is absent in healthy members. (B) The structure of a COMP monomer, showing thelocations of the N-terminal domain (NH2), the EGF-like and calmodulin-like repeats, and theC-terminal domain (COOH), is shown at the top.2.4.3 討論MED 是一種骨骼發(fā)育不良而又很難診斷的疾病，臨床診斷中具有代表性的表型包含風濕學上的關(guān)節(jié)疼痛或者神經(jīng)學上的肌病，但是最基本的骨骼發(fā)育不良（身材

第三章 COMP 突變蛋白的功能分析SPSS17 軟件分析數(shù)據(jù)顯著性。3.4 結(jié)果與討論3.4.1 COMP 重組質(zhì)粒的突變以及 FLAG 真核表達載體的構(gòu)建以 GV230-eGFP-COMP 為模板，利用表 3.2 的三對突變引物，分別進行突變，得到 COMP-D401N、COMP-T585M 以及 COMP-D472Y 突變質(zhì)粒，測序結(jié)果表明三個突變質(zhì)粒均突變成功，如圖 3.1 所示。野生型的 COMP 和突變成功的 COMP 構(gòu)建于 FLAG 標簽的真核表達載體上。以GV230-eGFP-COMP（COMP-D401N）質(zhì)粒為模板，PCR 擴增野生型和突變型 COMP連接在 pcDNAyu-2FLAG-3C 載體上，挑選單克隆菌落，如圖 3.2 酶切鑒定后，經(jīng)測序驗證構(gòu)建成功。A B

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 任永春;;調(diào)換座位和基因突變的關(guān)系[J];中學生物教學;2015年Z1期

2 馬曉梅;李洪波;;巧用實例及概念圖突破“基因突變”中的知識要點[J];中學生物教學;2015年17期

3 張樹虎;;基于生物學事實進行概念分步建構(gòu)教學——以“基因突變”為例[J];中學生物教學;2016年23期

4 付桂玲;;豐富的探究活動打破沉默學習[J];中學生物教學;2017年16期

5 樊向利;;有關(guān)“基因突變”的幾組概念辨析[J];生物學教學;2008年11期

6 李金安;蔣世祿;夏焦兵;劉永生;陳小兵;楊京舉;黃永海;肖安慶;王學宏;王彬;劉峰;張建尚;謝國富;蒙庚陽;;基因突變大部分是有害的嗎?——對2011年上海生物卷第8題的討論[J];中學生物教學;2011年10期

7 周

本文編號：2769337