【摘要】：研究背景:成骨細胞是間充質(zhì)來源的細胞,在骨生成的過程中起著至關(guān)重要的作用。成骨細胞最終成為較為穩(wěn)定的細胞貼附于骨的表面,或者通過分泌基質(zhì)包裹自己而成為骨細胞。最新的研究結(jié)果表明,成骨細胞還有一些內(nèi)分泌功能。總之,成骨細胞不僅僅能調(diào)節(jié)骨生成,而且能影響整個機體的平衡。機體內(nèi),成骨細胞所處的生理環(huán)境的氧濃度要明顯低于大氣以及正常孵箱的氧濃度,大約在3%到9%之間。再把諸如骨折之類的病理情況考慮進去,成骨細胞所處氧濃度的范圍大約在0.8%到9%之間。既然成骨細胞所處的氧濃度范圍變化如此之大,那么這些不同的氧濃度對成骨細胞的增殖、存活、遷移和分化有什么影響,以及是否存在一個最適的氧濃度,對臨床上某些疾病比如骨折、骨質(zhì)疏松等的干預有著極其重要的意義。目前還沒有人針對上述問題進行過系統(tǒng)的研究與探討。研究方法:我們將小鼠成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1細胞放進獨立的低氧小腔室中進行培養(yǎng),培養(yǎng)過程中的氧氣濃度分別設置為1%,3%,6%,9%,21%。用生長指數(shù)測定、EdU染色來檢測細胞的增殖情況;用活/死細胞染色來檢測細胞的存活情況;用平板劃痕實驗來檢測細胞的遷移能力;用免疫熒光、Western blotting檢測堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣蛋白(OCN)、Runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RunX2)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(DMP1)和基質(zhì)胞外磷酸糖蛋白(MEPE)等成骨相關(guān)蛋白的表達情況來檢測細胞成骨分化的情況。研究結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1細胞的增殖速度、成骨分化能力對應于氧濃度值大致上是一個鐘形曲線,并且最適氧濃度分別為6%與9%左右。而不同氧濃度下細胞的存活率的表現(xiàn)則因營養(yǎng)供應量的變化而表現(xiàn)出不同的特點,當用10%FBS培養(yǎng)時,各氧濃度組之間細胞存活率沒有統(tǒng)計學差異;當用1%FBS培養(yǎng)時,5%氧濃度組細胞的存活率明顯低于其余氧濃度組;當用0%FBS培養(yǎng)時,1%氧濃度組細胞存活率高于其余氧濃度組。另外,1%,3%,21%的氧濃度與6%,9%的氧濃度相比,前者能更好地促進細胞遷移。研究意義:我們首次系統(tǒng)地探究了不同氧濃度對成骨細胞前體細胞系MC3T3-E1細胞增殖、存活、遷移和分化的影響,并大致確定了各項的最適氧濃度范圍。這些結(jié)果對指導成骨細胞參與的病理過程,比如骨折、骨質(zhì)疏松癥、某些血管性疾病等的干預具有非常重要的參考價值,并且對成骨細胞作為治療細胞修復骨缺損的新科學思路具有一定的指導作用。但是具體的機制我們并沒有進行深入的探討,這需要對在不同氧濃度下成骨細胞的各種相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達、細胞因子釋放以及對各種刺激的反應進行更加全面、深入的研究。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R68
【圖文】：

３．１邋ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞增殖的最適氧濃度約為６％逡逑為了測試細胞在不同氧濃度下的增殖情況，我們首先做了生長指數(shù)的測定，逡逑又進行了邋ＥｄＵ染色。如圖１邋（Ａ）所示，ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１的生長指數(shù)對應于不同氧濃逡逑度大致是一個鐘形曲線：當氧濃度為１％時，生長指數(shù)并不高，隨著氧濃度逐漸逡逑增高，生長指數(shù)也隨之增高，一直增加到６％的氧濃度，然后，隨著氧濃度的繼逡逑續(xù)增加，生長指數(shù)逐漸下降，直到２１％氧濃度。２１％氧濃度下細胞的生長指數(shù)比逡逑１％氧濃度下的還要低，是本次實驗中各氧濃度下最低的。如圖１邋（Ｂ）所示，ＥｄＵ逡逑染色的結(jié)果大致上與生長指數(shù)的結(jié)果一致，但也有一些差別：ＥｄＵ染色結(jié)果提逡逑示１％氧濃度組與２１％氧濃度組的細胞增殖沒有統(tǒng)計學意義上的差別，而增長指逡逑數(shù)的結(jié)果提示有顯著差異。盡管兩個實驗都提示９％氧濃度下的細胞增殖快于３％逡逑氧濃度下的，但是ＥｄＵ染色結(jié)果的差異較生長指數(shù)測定的結(jié)果更明顯一些。不逡逑管這些細節(jié)上的差別

義上的差異，所以我們在每個氧濃度試驗下增加了血清缺乏組與血清剝奪組。逡逑血清缺乏組的意思是細胞在僅含１％ＦＢＳ的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，血清剝奪組的意思是逡逑細胞在不含ＦＢＳ的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如圖２所示，不同氧濃度下ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞逡逑的存活情況受血清含量的影響。在正常培養(yǎng)基組（１０％ＦＢＳ），不同氧濃度試驗逡逑之間細胞的存活率沒有統(tǒng)計學差異，細胞都存活得很好，每個氧濃度組存活率逡逑都接近１００％。在血清缺乏組（１％ＦＢＳ），６％的氧濃度下細胞的存活率（約為７４％）逡逑低于其它的氧濃度組（存活率約為９２％），而１％，３％，９％，２１％氧濃度組之逡逑間細胞的存活率沒有明顯差異。有意思的是，在血清剝奪組（０％ＦＢＳ），１％氧濃逡逑度下細胞的存活率要高于其它氧濃度組。１％氧濃度組細胞的存活率約為７７％，逡逑而３％，６％，９％，２１邋％氧濃度組細胞的存活率在６３％到６８％之間，并且它們逡逑之間的數(shù)值沒有統(tǒng)計學差異。所以

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