【摘要】：目的:惡性脊柱腫瘤具有進(jìn)展迅速的特點,能夠破壞脊柱或其他組織,進(jìn)而向周邊器官轉(zhuǎn)移,其手術(shù)難度高,易復(fù)發(fā),預(yù)后差,因而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存周期。p53凋亡影響蛋白是p53結(jié)合蛋白家族中促凋亡蛋白的一員,能通過調(diào)節(jié)p53途徑來增強(qiáng)凋亡活性。過去的研究發(fā)現(xiàn)ASPP2在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中起著關(guān)鍵作用,然而ASPP2對惡性脊柱腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制還沒有被闡明。材料與方法:我們收集了惡性脊柱腫瘤組織及鄰近組織,分別用實時定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)對ASPP2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。此外,我分析了患者臨床病理資料與ASPP2表達(dá)關(guān)系,并根據(jù)患者隨訪資料繪制生存曲線。我們用ASPP2過表達(dá)質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞;運(yùn)用MTT實驗來檢測腫瘤細(xì)胞的增殖速率;用蛋白免疫印跡檢測了 p53的表達(dá)水平;通過對Caspase 3活性的測定來評價其對細(xì)胞凋亡的影響;使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測腫瘤細(xì)胞凋亡;用實時定量PCR來檢測Bcl-2和Bax的基因表達(dá)變化。結(jié)果:在惡性脊柱腫瘤組織中,ASPP2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05);此外,患者臨床病理資料與ASPP2表達(dá)關(guān)系顯示ASPP2表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤分期呈負(fù)相關(guān);根據(jù)患者隨訪資料繪制生存曲線,結(jié)果顯示患者生存期與ASPP2表達(dá)正相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)ASPP2的質(zhì)粒,能夠使腫瘤細(xì)胞凋亡比例增加,抑制其增殖,同時伴隨著Bcl-2表達(dá)降低,Bax表達(dá)升高,以及Caspase 3和p53更高的活性,裸鼠成瘤實驗也證明ASPP2過表達(dá)細(xì)胞增殖能力受到抑制。結(jié)論:ASPP2基因在惡性脊柱腫瘤組織中表達(dá)下調(diào);ASPP2可以通過調(diào)節(jié)p53表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并抑制惡性脊柱腫瘤細(xì)胞的增殖,因此可以作為腫瘤診斷和預(yù)后分析的一個分子靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738
【圖文】：

，當(dāng)Ｐ＜０．０５時，則認(rèn)為差別有顯著性。逡逑果逡逑２在惡性脊柱腫瘤組織及癌旁組織中的ｍＲＮＡ達(dá)逡逑究報道，ＡＳＰＰ２在不同的腫瘤組織及癌旁組織中差異性表達(dá)。在惡性脊柱腫瘤組織及其癌旁組織中表達(dá)的差異性，我們從醫(yī)院骨科獲得惡性脊柱腫瘤組織及其癌旁組織各３０例（ｎ＝３０）ＰＣＲ檢測ＡＳＰＰ２基因在腫瘤組織及其癌旁組織中的表達(dá)，組織比，腫瘤組織中ＡＳＰＰ２ｍＲＮＡ表達(dá)降低，Ｐ＜０．０５有統(tǒng)計＊逡逑

濃縮和定量后，得到質(zhì)粒。將質(zhì)粒，通過ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶，在３７°Ｃ水浴鍋逡逑中條件下水浴，１．５ｈ后切^u，然后進(jìn)行跑膠鑒定。結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒酶切正逡逑確（圖２．２）。構(gòu)建的質(zhì)粒送上海生工測序，結(jié)果顯示：測序正確（圖２．３）。逡逑Ｍａｋｅｒ邋１２邐３邐４逡逑圖２．２酶切鑒定重組質(zhì)粒逡逑（Ｍ：邋ＤＮＡＭａｋｅｒ；邋１、２、３、４：重組質(zhì)粒邋ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＡＳＰＰ２）逡逑ｌｄｃｎ？ｔｙ＝邋９４．９５Ｘ逡逑１邐邐邐邐２３９５逡逑０邐１０邐２０邐３０邐４０邐５０邐６０邐７０邐８０邐９０邐１００邐１１０邐１２０逡逑ｌｌ？ｌｌｌｌｌｌ？ｌｌｌｌ匿ＭＩ｜■ｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌ？ＭＩＩＭｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌ｜ｌｌｌＭＩＩＭｌｌｒｒｒｌ＞ｔＭ事ｒｌｌｌｌｌＭ，ｌｌｌｌｌＭＩ？ｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌ■ｌ逡逑ＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣＧｍＵＣＧＧＣＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＣ＾ｔｔＷ＊Ｍｇｊｇ逡逑邐灥擺ｊ逡逑ａｔｇｔｃｃｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｃｇａｔｇｃａａｃｔｃｔａｔｃｇｔｃａｃａｇｔｃａａｇａａ？？ａｔａａｇａｇａｃａｃａｔｇｇｃｔｇａｇｇｔｇａａｔｇｃａｔｃｃｃｃａｃｔｔ？逡逑圖２．

邐３逡逑Ｂ１Ｂ逡逑圖２．１左：從腫瘤細(xì)胞中提取到的人的總ＲＮＡ邋（邋１、２：人的總ＲＮＡ）；逡逑右：通過ＰＣＲ獲得目的基因ＡＳＰＰ２（Ｍ：邋ＤＮＡＭａｋｅｒ；邋１．邋２、３：邋ＰＣＲ產(chǎn)物）逡逑２）酶切、連接并測序鑒定重組質(zhì)粒ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＡＳＰＰ２重組質(zhì)粒正確。逡逑ＰＣＲ產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收純化，并以３：邋１的比例連接到ｐｃＤＮＡ３．１逡逑質(zhì)粒上。連接反應(yīng)在４°Ｃ進(jìn)行１６個小時。剔１０９感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化克隆質(zhì)粒之后，逡逑用ＬＢ固體平板和ＬＢ液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。提取得到的ｐｃＤＮＡ３．１－ＡＳＰＰ２，在經(jīng)過逡逑濃縮和定量后，得到質(zhì)粒。將質(zhì)粒，通過ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶，在３７°Ｃ水浴鍋逡逑中條件下水浴，１．５ｈ后切^u，然后進(jìn)行跑膠鑒定。結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒酶切正逡逑確（圖２．２）。構(gòu)建的質(zhì)粒送上海生工測序，結(jié)果顯示：測序正確（圖２．３）。逡逑Ｍａｋｅｒ邋１２邐３邐４逡逑圖２．２酶切鑒定重組質(zhì)粒逡逑（Ｍ：邋ＤＮＡＭａｋｅｒ；邋１、２、３、４：重組質(zhì)粒邋ｐｃＤＮＡ３．１（－）－ＡＳＰＰ２）逡逑ｌｄｃｎ？ｔｙ＝邋９４．９５Ｘ逡逑１邐邐邐邐２３９５逡逑０邐１０邐２０邐３０邐４０邐５０邐６０邐７０邐８０邐９０邐１００邐１１０邐１２０逡逑ｌｌ？ｌｌｌｌｌｌ？ｌｌｌｌ匿ＭＩ｜■ｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌ？ＭＩＩＭｌｌｌＭｌｌｌｌｌｌｌｌｌＭｌｌｌｌ｜ｌｌｌＭＩＩＭｌｌｒｒｒｌ＞ｔＭ事ｒｌｌｌｌｌＭ

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