【摘要】：研究背景:冠心病是目前嚴重危害公眾健康的具有高發(fā)病率的一類疾病,冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting,CABG)以心肌再血管化為目的,成為外科方式治療嚴重冠心病的最終有效手段。目前心肌再血管化常用的橋血管是自體靜脈,但即使應用多種藥物治療,術后兩年仍約有20%-40%的移植靜脈狹窄甚至閉塞,CABG的療效隨之也受到嚴重影響。因此,如何防止或減緩移植靜脈的再狹窄已經(jīng)成為心臟外科冠脈治療首要解決的問題。血管內皮損傷通常被認為是移植靜脈內膜增生的始動環(huán)節(jié),內皮細胞(endothelial cells,ECs)作為重要的血管屏障,能夠防止單核細胞粘附及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增生。血管內皮細胞的凋亡破壞了這一血管屏障,并將VSMCs直接暴露在血流的沖擊中,隨后導致了炎癥細胞的粘附和激活。處于激活狀態(tài)的炎癥細胞會釋放過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),一般包括H202和超氧化物陰離子O2-等。ROS是激發(fā)氧化應激瀑布反應的關鍵因素,這些ROS不僅導致細胞凋亡,而且誘發(fā)大量炎癥因子的產生,這些炎癥因子將會進一步趨化、招募更多的炎癥細胞,比如單核-巨噬細胞等向損傷部位快速聚集。這一惡性循環(huán)造成大量ROS的產生,從而對血管內皮細胞造成持續(xù)、劇烈的氧化應激損傷,延緩損傷血管的再內皮化,最終導致血管內膜增生。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能夠從骨髓組織被動員進入外周血并特異性遷移、歸巢到血管損傷部位,分化成為內皮細胞,并發(fā)揮內皮細胞功能,以促進內皮修復。MSCs能夠有效歸巢是其發(fā)揮促進組織修復功能的重要前提,大家廣泛認為基質細胞衍生因子-1α/C-X-C亞族趨化因子受體4(SDF-lα/CXCR4)在調節(jié)干細胞遷移的過程中具有重要作用。因此,上調MSCs的CXCR4表達可以促進其歸巢至損傷血管內皮。但是,有研究發(fā)現(xiàn)靜脈移植后,移植血管內膜和循環(huán)血液中均可檢測到氧化應激反應,在術后較短時間內即發(fā)生,并且可以持續(xù)數(shù)周,另外在大鼠頸動脈球囊損傷模型中也發(fā)現(xiàn)氧化應激參與了內膜增生。在形成的氧化應激環(huán)境中,各種反應氧產物,包括H202和超氧化物陰離子O2-等大量產生,這些大量和/或持續(xù)的氧化應激產物刺激可以降低MSCs的功能及活性,并增加其凋亡,嚴重影響MSCs移植的治療效果。核因子-κB(nuclear factor of kappa B,NF-κB)通路廣泛參與了對多種趨化蛋白、細胞因子和粘附分子等翻譯產物的基因表達及調控過程。IκB kinase(IKK)復合物包括兩個催化亞基IKK-α和IKK-β,及一個調節(jié)亞基(IKK-γ/NEMO)。IKK-α和IKK-β對于NF-κB通路發(fā)揮調節(jié)功能具有關鍵作用。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)基因可以編碼抗凋亡蛋白Bcl-2,并且Bcl-2的啟動子上包含NF-κB的特異性結合序列從而受其調控,所以理論上NF-κB能夠借助上調Bcl-2及其它凋亡抑制基因的表達而減輕細胞凋亡。其它研究也發(fā)現(xiàn),NF-κB通路與定向遷移功能的調節(jié)有關。因此我們試圖利用腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),一種重要的促炎癥因子刺激來實現(xiàn)NF-κB通路的活化,促進MSCs在氧化應激環(huán)境中的存活及遷移功能,以更有效的實現(xiàn)移植靜脈內膜增生的預防及治療。本研究旨在通過TNF-α預處理(precondition,PC)MSCs,觀察MSCs表達的總CXCR4及細胞表面CXCR4的水平、細胞遷移活性、增殖及分泌功能的變化。借助這些實驗我們可以明確TNF-α對于MSCs活性的調節(jié)作用,并且觀察在這些生物學功能變化過程中NF-κB通路發(fā)揮的作用。然后我們通過篩選出以IKK-α為靶基因的表達水平有明顯改變的miRNA,進一步探討miRNA在在TNF-α調控NF-κB通路過程中所發(fā)揮的作用。利用動物實驗則可以驗證TNF-α通過NF-κB通路促進MSCs在氧化應激環(huán)境下的存活及遷移功能的作用,并觀察TNF-α預處理的MSCs治療移植靜脈內膜增生的效果�？偟膩碚f,本實驗著重于探討TNF-α對于MSCs在氧化應激環(huán)境下的存活及遷移功能的影響及其機制,并證實TNF-α預處理能否改善MSCs對于移植靜脈內膜增生的預防及治療作用。本研究內容共包括以下三個部分。第一部分腫瘤壞死因子-α通過NF-κB通路促進MSCs在氧化應激環(huán)境中的存活及遷移功能目的:研究腫瘤壞死因子-c(TNF-α)對于間充質干細胞(MSCs)的遷移、增殖、分泌功能等生物學功能的影響,并進一步明確TNF-α對于MSCs在氧化應激環(huán)境中存活及遷移等功能的影響,同時闡述NF-κB通路在這些調節(jié)過程中發(fā)揮的作用。方法:1.用不同濃度的TNF-α(0、10、30、50ng/ml)刺激MSCs,24小時后應用Western blot檢測總蛋白中NF-κB-p65和p-NF-κB-p65表達水平的變化,并選定最佳作用濃度。2.NF-κB通路拮抗劑IKK Ⅻ提前30分鐘預處理MSCs,再選用TNF-α 進行刺激,Western blot 檢測 p-IKK-α/IKK-α 和 p-IKK-β/IKK-β 的表達變化,明確TNF-α對于NF-κB通路的活化作用。實驗分組:Ⅰ.對照組,使用α-MEM+10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基,不添加IKK Ⅻ及TNF-α;Ⅱ.TNF-αα組:完全培養(yǎng)基中添加TNF-α(終濃度為50ng/ml),培養(yǎng)24小時;Ⅲ.IKK Ⅻ+ TNF-α組:培養(yǎng)基中先添加IKK Ⅻ(終濃度為5μM),培養(yǎng)30分鐘,以阻斷NF-κB通路,然后加入TNF-α(終濃度為50ng/ml),培養(yǎng)24小時;Ⅳ.IKK Ⅻ組:培養(yǎng)基中添加IKK Ⅻ(終濃度為5μM),培養(yǎng)24小時。3.流式細胞周期檢測分析TNF-α對于MSCs細胞周期的影響;CCK-8檢測分析TNF-α對于MSCs細胞總活性的影響;EdU檢測分析MSCs增殖功能的改變。4.IKK Ⅻ+TNF-α組額外加入SB203580(P38-MAPK通路拮抗劑),Western blot檢測p-p38和p38的表達變化,明確TNF-α對于P38-MAPK通路的作用;CCK-8檢測NF-κB通路和P38-MAPK通路對于細胞活性的影響。5.Westernblot檢測p-NF-κB-p65/NF-κB-p65和CXCR4的表達變化,并應用流式細胞表型分析檢測MSCs表面CXCR4的表達,明確NF-κB通路對于CXCR4表達的調控作用;Transwell實驗證實TNF-α對于MSCs遷移功能的影響。6.Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測各組MSCs在氧化應激環(huán)境中的凋亡情況,并應用Western blot檢測各組MSCs在氧化應激環(huán)境中Bcl-2和CXCR4的表達變化,以研究氧化應激環(huán)境對于MSCs產生的影響,及TNF-α預處理對其存活及遷移功能的作用。結果:1.隨著TNF-α刺激濃度不斷提高,p-NF-κB-p65表達量逐步增加,表現(xiàn)為劑量依賴性,50ng/ml濃度的TNF-α顯著激活了NF-κB通路。2.TNF-α刺激后,NF-κB通路的上游調節(jié)蛋白IKK-α/β的磷酸化明顯上調,IKK Ⅻ能夠阻斷此作用。3.流式細胞周期檢測發(fā)現(xiàn),TNF-α上調NF-κB通路后,位于S期的細胞比率明顯上升,提示細胞增殖能力可能獲得了提升;CCK-8檢測結果顯示TNF-α組細胞的總活性顯著提高,而且IKK Ⅻ能夠阻斷此作用,但是IKK Ⅻ+TNF-α組細胞總活性低于IKK Ⅻ組;EdU檢測證實了 TNF-α對于MSCs的增殖促進作用,并且IKK Ⅻ能夠拮抗此效應。4.TNF-α同時激活了P38-MAPK通路,SB203580可以阻斷該通路的激活。CCK-8實驗顯示IKK Ⅻ+TNF-α組P38-MAPK通路的激活導致了細胞活性的下降,應用SB203580額外阻斷P38-MAPK通路后總細胞活性顯著升高。5.TNF-α顯著提高了p-NF-κB-p65和CXCR4的表達,p-NF-κB-p65和CXCR4的表達有相同的變化趨勢;Transwell實驗證實TNF-α明顯促進了MSCs的遷移功能,IKK Ⅻ能夠拮抗此效應。6.Annexin V-FITC/PI流式細胞凋亡術檢測發(fā)現(xiàn)MSCs在氧化應激環(huán)境中出現(xiàn)大量凋亡,而TNF-α預處理能夠顯著減輕凋亡。氧化應激導致Bcl-2和CXCR4的表達下降,TNF-α可以明顯上調其表達,并且IKK Ⅻ能夠拮抗此效應。結論:TNF-α通過IKK-α/β的磷酸化激活NF-κB通路。TNF-α顯著增強了MSCs的增殖和遷移功能,在這些過程中NF-κB通路起著關鍵的調控作用。TNF-α通過NF-κB通路明顯減輕了 H2O2誘導的細胞凋亡水平,并且有效改善了氧化應激環(huán)境中MSCs的遷移功能。第二部分miR-23b-3p參與腫瘤壞死因子-α對NF-κB通路活化的調控過程目的:研究微小RNA(microRNA,miRNA)在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對間充質干細胞NF-κB通路調控過程中所起的作用。篩選出與催化亞基IKK-α相關程度高的miRNA,并進行內源及外源性驗證。同時研究miRNA表達與NF-κB通路及下游功能活性的關系。方法:1.根據(jù) TargetScan7.1、miRbase、microRNA.org等對 miRNA 靶基因及其結合位點的預測,找出可能以IKK-α為靶基因的miRNA,并以這些miRNA作為目標進行后續(xù)研究。通過qRT-PCR檢測TNF-α作用于MSCs后這些miRNA的變化,并篩選出最相關的miRNA。2.合成目標miRNA的模擬物(mimic)及抑制物(inhibitor),并合成IKK-α的野生型及突變型雙熒光素酶報告基因質粒。利用雙熒光素酶實驗外源性驗證IKK-α是否為目標miRNA的靶基因。3.Western檢測目標miRNA與NF-κB通路活性及CXCR4表達水平的關系。4.Transwell試驗檢測瞬時轉染目標miRNA的inhibitor對MSCs遷移能力的影響。結果:1.根據(jù)網(wǎng)站預測及qRT-PCR分析,我們發(fā)現(xiàn)以IKK-α為靶基因的miRNA中,miR-23b-3p在TNF-α刺激后下降最為明顯,故將以miR-23b-3p作為目標進行研究。2.miR-23b-3p可以明顯抑制轉染野生型報告質粒的細胞中螢火蟲熒光素酶表達,而不能明顯抑制轉染突變型報告質粒細胞中螢火蟲熒光素酶表達。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)外源驗證了 IKK-α為miR-23b-3p的靶基因。3.miR-23b-3p mimic能夠下調NF-κB通路活性,并降低CXCR4的表達水平。miR-23b-3p inhibitor可以活化NF-κB通路活性,并促進CXCR4的表達。4.Tanswell試驗證實瞬時轉染miR-23b-3p inhibitor能夠促進MSCs的遷移。結論:TNF-α可以下調miR-23b-3p的表達,減弱miR-23b-3p對于IKK-α的抑制作用,從而活化NF-κB通路,并促進了MSCs的遷移功能。miR-23b-3p參與了TNF-α對NF-κB通路的調控過程。第三部分腫瘤壞死因子-α預處理的MSCs治療移植靜脈內膜增生的效果研究目的:研究腫瘤壞死因子-α(TNF-α)預處理對間充質干細胞(MSCs)體內存活及遷移能力的影響,探討TNF-α預處理MSCs治療移植靜脈內膜增生的效果。方法:1.TNF-α預處理MSCs24小時(TNF-α-PCMSCs),CM-Dil標記細胞。隨后收集CM-Dil標記的TNF-α-PCMSCs,并通過尾靜脈注入靜脈移植大鼠模型體內。2.術后1天、1周,分別收集大鼠血液標本,并分離血清,ELISA檢測標本中的丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)濃度,以評價模型體內氧化應激水平。3.藥物預處理MSCs 24小時后,收集各組細胞培養(yǎng)液,離心后用于ELISA檢測細胞分泌VEGF和HGF水平。4.1周后取材移植靜脈,制成冰凍切片,并立即在熒光顯微鏡下觀察以示蹤細胞歸巢情況。5.Tunel法檢測移植靜脈標本的內皮細胞凋亡程度。6.4周后取材移植靜脈,制備成石蠟標本,使用Van Gieson染色以檢測移植靜脈的內膜增生程度。結果:1.活細胞示蹤劑CM-Dil能夠成功標記MSCs,且不影響細胞活性。2.靜脈移植術后1天,收集血清中MDA的濃度明顯增加,靜脈移植術后的大鼠血液循環(huán)中存在氧化應激。3.靜脈移植1周以后,TNF-α-PCMSCs治療組較Non-PCMSCs組中MDA的血清含量下降更加顯著。4.TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)靜脈移植后即出現(xiàn)內皮細胞凋亡,TNF-α-PCMSCs治療能夠顯著減輕靜脈移植后血管內皮細胞凋亡。5.TNF-α-+PCMSCs在正常環(huán)境或氧化應激環(huán)境下,VEGF和HGF的分泌水平均較Non-PCMSCs明顯升高。6.通過熒光顯微鏡觀察CM-Dil標記的MSCs的歸巢能力,對比Non-PCMSCs,更多數(shù)量的TNF-α-PCMSCs歸巢到了移植靜脈內膜,IKK Ⅻ預處理則可以阻斷這一效應。7.VanGieson染色發(fā)現(xiàn),TNF-α-PCMSCs組移植靜脈的新生內膜厚度較Non-PCMSCs組變薄,血管內膜增生程度顯著減輕。結論:靜脈移植術后的血液循環(huán)中存在氧化應激狀態(tài),TNF-α可以改善氧化應激環(huán)境中MSCs的存活和遷移功能,從而使更多數(shù)量的TNF-α-PCMSCs能夠歸巢到移植靜脈內膜,以促進血管再內皮化。IKK Ⅻ預處理能夠阻斷這些效應,則可以證實在這些過程中NF-κB通路起著關鍵的調控作用。另外TNF-α-pCMSCs可以通過旁分泌VEGF和HGF等促生存因子減輕氧化應激導致的內皮細胞凋亡,并且內皮細胞凋亡的減輕反過來可以降低氧化應激水平,二者共同作用從而使移植靜脈內膜增生得到有效緩解。利用經(jīng)TNF-α預處理的MSCs治療,可以更有效的防治移植靜脈的內膜增生。創(chuàng)新及意義本課題證實了TNF-α可以通過促進IKK-α/β的磷酸化激活NF-κB通路,并且顯著增強了MSCs的遷移功能和抗凋亡活性,在這些過程中NF-κB通路起著關鍵的調控作用。并且發(fā)現(xiàn)miR-23b-3p參與了TNF-α對NF-κB通路的調控過程,miRNA對于通路調控的復雜機制還需進一步研究。TNF-α通過活化NF-κB通路可以改善氧化應激環(huán)境中MSCs的遷移功能,并增加術后動物模型體內MSCs的存活數(shù)量。利用經(jīng)TNF-α預處理的MSCs治療,可以更有效的防治移植靜脈的內膜增生,改善MSCs預防橋血管狹窄的作用。本課題為提高間充質干細胞的移植治療效果提供了理論基礎與新思路。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R654.2
【圖文】：

１．邋（Ａ）體外培養(yǎng)至第３代的ＭＳＣｓ呈現(xiàn)均一的成纖維細胞樣形態(tài)，細胞呈逡逑梭形，旋渦狀排列生長；（Ｂ）流式細胞術鑒定結果顯示：造血細胞標志物逡逑Ｄ３４和ＣＤ４５陰性；干細胞抗原標志物ＣＤ２９、ＣＤ４４和ＣＤ９０陽性。結果證逡逑試驗中所用的細胞群為ＭＳＣｓ。逡逑

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【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 李欣;楊作成;;外源性外泌體在細胞凋亡中的調控作用[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2017年02期

2 鄭華峰;陶晶;張斌;王純;吳淳;;MicroRNA-155在高糖誘導人血管內皮細胞中的表達及功能研究[J];臨床心血管病雜志;2016年04期

本文編號：2753477