【摘要】：目的探討負(fù)載miR-126的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌體(exosomes)對(duì)早期激素誘導(dǎo)的缺血性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH)的治療作用。方法體外實(shí)驗(yàn),采用超速離心法分離提純BMSCs分泌的外泌體(MSC-Exo)以及micrON?miRNA-126 mimic轉(zhuǎn)染的BMSCs分泌的外泌體(miR-126-MSC-Exo),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)其miR-126相對(duì)含量。將生長(zhǎng)良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分為3組:miR-126-MSC-Exo組、MSC-Exo組和對(duì)照組,分別以miR-126-MSC-Exo、MSC-Exo及等體積PBS進(jìn)行處理,通過MTT、劃痕實(shí)驗(yàn)以及成管實(shí)驗(yàn)分別觀察各組細(xì)胞增殖、遷移和毛細(xì)血管網(wǎng)的形成情況,Western blot檢測(cè)各組HUVECs中spred1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)的表達(dá)情況。在體實(shí)驗(yàn),脂多糖(LPS)及甲潑尼松龍(MPS)注射構(gòu)建大鼠SANFH模型,將SANFH大鼠分為3組:miR-126-MSC-Exo組、MSC-Exo組和對(duì)照組,鼠尾靜脈分別注射miR-126-MSC-Exo、MSC-Exo及等體積PBS,6周后,CD31免疫熒光染色觀察股骨頭血管數(shù)量,HE染色及micro-CT掃描觀察骨質(zhì)情況,以評(píng)估負(fù)載miR-126的外泌體對(duì)大鼠早期SANFH的治療作用。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-126-MSC-Exo中miR-126相對(duì)含量顯著高于MSC-Exo。miR-126-MSC-Exo組HUVECs的增殖、遷移和成管能力顯著高于MSC-Exo組(P0.05),spred1表達(dá)水平較MSC-Exo組顯著降低、而VEGFA的表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-126-MSC-Exo組大鼠股骨頭壞死區(qū)CD31免疫熒光標(biāo)記的數(shù)量較MSC-Exo組顯著增多(P0.05),HE染色結(jié)果顯示與MSC-Exo組和對(duì)照組相比,miR-126-MSC-Exo組小梁組織排列規(guī)則,骨細(xì)胞空陷窩率明顯降低(P0.05),對(duì)照組中小梁結(jié)構(gòu)紊亂骨細(xì)胞空陷窩率明顯高于miR-126-MSC-Exo組和MSC-Exo組,骨髓顆粒細(xì)胞和脂肪組織也明顯增多。股骨頭壞死區(qū)micro-CT掃描顯示miR-126-MSC-Exo組的小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、小梁數(shù)(trabecular number,Tb.N)和單位組織體積骨量(bone volume per tissue volume,BV/TV)顯著高于MSC-Exo組和對(duì)照組(P0.05),而小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)顯著降低(P0.05)。結(jié)論負(fù)載miR-126的外泌體通過增強(qiáng)血管新生、促進(jìn)成骨治療大鼠早期SANFH。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681.8
【圖文】：

1 miRNA-126-MSC-Exo 和 MSC-Exo 中 miRNA-126 的相對(duì)RNA-126-MSC-Exo 中的 miR-126 相對(duì)含量顯著高于 MSC-Exo 組；*表示 P差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義光定量PCR檢測(cè)miRNA-126-MSC-Exo 和MSC-Exo中miR的相對(duì)含量（n=3, x±s）miRNA-126-MSC-Exo 組 MSC-Exo 組26-3p 0.85±0.03 0.15±0.05*示 P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外泌體的鑒定和分析射電鏡掃描提純的 MSC-Exo，其形態(tài)大多為杯形或圓形結(jié)構(gòu)0~100nm 之間（圖.2A）。倒置熒光顯微鏡下觀察 DiL 標(biāo)記的 MCs 攝取，且其主要集中在細(xì)胞核附近（圖.2B）。Western bl

圖 2 透射電鏡及 Western Blot 鑒定和分析 MSC-Exo注：A: 透射電鏡觀察外泌體的形態(tài) (×40000); B: HUVECs 細(xì)胞攝取外泌體 (×400); C:Western blotting 檢測(cè)外泌體 CD9, CD63 and CD81 蛋白表達(dá)（三）miRNA-126-MSC-Exo 促進(jìn) HUVECs 增殖、遷移和成管1、MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24h 時(shí) HUVECs 的增值率在 miR-126-MSC-Exo 組 HUVECs 的增值率顯著強(qiáng)于 MSC-Exo 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3、表 2。

圖 2 透射電鏡及 Western Blot 鑒定和分析 MSC-E電鏡觀察外泌體的形態(tài) (×40000); B: HUVECs 細(xì)胞攝取外泌體 (×Western blotting 檢測(cè)外泌體 CD9, CD63 and CD81 蛋白表達(dá)miRNA-126-MSC-Exo 促進(jìn) HUVECs 增殖、遷移和成管 實(shí)驗(yàn)：24h 時(shí) HUVECs 的增值率在 miR-126-MSC-Exo 組 HUVECs SC-Exo 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3、表

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2745778