【摘要】：第一部分靶向抑制Id1基因?qū)侨饬黾?xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為及成骨分化影響目的:通過抑制分化抑制因子1(Id1)的表達(dá)探討其對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為及成骨分化的影響及相關(guān)機制。方法:(1)運用重組腺病毒Ad-si Id1處理骨肉瘤細(xì)胞MG63,重組腺病毒Ad-RFP作為腺病毒對照組,未用任何病毒處理的MG63作為空白對照組,調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞MG63中Id1的表達(dá)水平;(2)運用半定量RT-PCR和western blot技術(shù)分別在m RNA水平及蛋白水平確定重組腺病毒Ad-si Id1及Ad-RFP對骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞的調(diào)控效果;(3)運用Annexin V-FITC單染法及DAPI染色法檢測不同處理后骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況,FCM法檢測對細(xì)胞周期分布的影響;(4)運用ALP染色及茜素紅S染色檢測調(diào)控Id1表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞成骨分化能力;(5)運用western blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Survivin以及Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、ROR2和CHOP蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)重組腺病毒Ad-si Id1感染MG63細(xì)胞后,Id1在m RNA及蛋白表達(dá)水平較對照組均下降(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05);(2)沉默Id1后骨肉瘤細(xì)胞凋亡率較對照組提高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05);(3)沉默Id1后可促進(jìn)骨肉瘤早期成骨分化,對晚期成骨分化無作用;(4)沉默Id1后抗凋亡因子Bcl-2及Survivin表達(dá)較對照組均下調(diào)(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05);(5)沉默Id1后Wnt信號通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、ROR2和CHOP蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05)。結(jié)論:重組腺病毒Ad-si Id1可以抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞Id1表達(dá);抑制Id1基因的表達(dá)可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡,同時抑制抗凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Survivin的表達(dá);抑制Id1的表達(dá)可以促進(jìn)骨肉瘤早期成骨分化,不能促進(jìn)晚期成骨分化,其作用可能與抑制Wnt信號通路相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。第二部分靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9對骨肉瘤細(xì)胞成骨分化作用目的:在體外及體內(nèi)水平探討抑制分化抑制因子1(Id1)聯(lián)合BMP9對骨肉瘤細(xì)胞成骨分化的作用及其機制,為骨肉瘤的靶向治療提供相關(guān)依據(jù)。方法:(1)運用重組腺病毒Ad-si Id1、Ad-BMP9分別及聯(lián)合處理骨肉瘤細(xì)胞MG63,重組腺病毒Ad-RFP作為腺病毒對照,誘導(dǎo)其成骨分化;(2)應(yīng)用western blot技術(shù)在蛋白水平比較重組腺病毒Ad-si Id1、Ad-BMP9及Ad-RFP對骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞的調(diào)控效果;(3)在體外實驗中應(yīng)用堿性磷酸酶染色(ALP)及讀數(shù)法檢測骨肉瘤早期成骨分化,通過western blot技術(shù)檢測中晚期成骨分化指標(biāo)OPN的表達(dá),并用鈣鹽沉積實驗檢測晚期成骨分化指標(biāo);(4)在體內(nèi)實驗中,采用原位成瘤法,運用體外活體成像技術(shù)觀察腫瘤大小及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況,運用HE染色,masson染色觀察體內(nèi)成瘤組織成骨分化程度;(5)通過重組腺病毒技術(shù)調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞MG63中Id1、BMP9的表達(dá)水平后,分別在24 h和48 h運用western Blot技術(shù)在蛋白水平檢測相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:(1)Ad-BMP9較對照組可增加細(xì)胞內(nèi)BMP9表達(dá)量(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05),BMP9+si Id1組與BMP9組相比BMP9表達(dá)量無差異;si Id1組Id1表達(dá)較其他組降低(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05);BMP9+si Id1組的Id1表達(dá)均較其他組高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05),BMP9組和對照組相比Id1的表達(dá)量并無差異;(2)通過重組腺病毒過表達(dá)BMP9或抑制Id1表達(dá)后骨肉瘤細(xì)胞ALP的活性及ALP染色相對于對照組增高(差異有統(tǒng)計學(xué)差異,p0.05);靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9相對其他實驗組可有效地促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG63堿性磷酸酶活性及ALP染色(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.05);(3)中晚期成骨分化指標(biāo)OPN表達(dá)在感染Ad-BMP9后均增高(高于對照組與si Id1組),抑制Id1后OPN的表達(dá)也比對照組高,且靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9組OPN的表達(dá)量最高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05);(4)對于晚期成骨分化指標(biāo)茜素紅S染色,si Id1組和RFP組無鈣鹽沉積,BMP9組有少許鈣鹽沉積,但靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9組的鈣沉積最明顯;(5)體內(nèi)實驗中各組均成瘤,且均未檢測到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,瘤體大小無統(tǒng)計學(xué)差異;HE染色及Masson染色結(jié)果顯示對照組無成骨分化能力,單獨抑制Id1或增強BMP9表達(dá)雖可以促進(jìn)骨肉瘤分化,但兩者聯(lián)合后成骨分化能力最強。(6)對于AKT信號通路而言,成骨分化最強的一組即BMP9+si Id1組,p-AKT的表達(dá)并不是最強的,成骨分化能力較弱的BMP9組其p-AKT的表達(dá)在24 h及48 h均表達(dá)最高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01),而同樣并無成骨分化能力的si Id1組p-AKT的表達(dá)在24 h時與空白對照組無明顯差異,在48 h較對照組增高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01);(7)對于經(jīng)典Wnt信號通路關(guān)鍵因子β-catenin而言,24 h時,BMP9組與si Id1組的表達(dá)均低于BMP9+si Id1組與對照組(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01);48 h時BMP9表達(dá)最高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01),si Id1組較BMP9+si Id1組表達(dá)降低(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01),成骨分化能力最強的聯(lián)合組較BMP9組β-catenin表達(dá)低,較空白對照組表達(dá)高(差異有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01);(8)GSK-3β作為wnt信號通路的負(fù)向調(diào)控因子,其趨勢與β-catenin相反;在24 h時BMP9組表達(dá)最高,空白組最低;在48 h時雖然si Id1組的表達(dá)與BMP9+si Id1組無明顯差異,但在24 h時si Id1組的表達(dá)較低。結(jié)論:(1)體外實驗中靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9的ALP染色及讀數(shù)增強,OPN蛋白水平表達(dá)上調(diào),鈣鹽沉積也增強;單獨過表達(dá)BMP9后對骨肉瘤早期、中晚期成骨分化能力較弱;單獨抑制Id1的表達(dá)只可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞早期成骨分化指標(biāo)ALP的增加;表明兩者促成骨分化作用均較靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9弱;(2)體內(nèi)實驗中裸鼠成瘤大小并無明顯差異,均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而靶向抑制Id1聯(lián)合BMP9組骨樣基質(zhì)增加;這些結(jié)果表明抑制Id1聯(lián)合BMP9可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG63成骨分化;(3)通過檢測相關(guān)信號通路關(guān)鍵因子的表達(dá),成骨分化能力最強的BMP9+si Id1組的p-AKT、GSK-3β表達(dá)在24 h較BMP9組低,較RFP組高,β-catenin表達(dá)在24 h較RFP組低,si Id1組高;BMP9+si Id1組的p-AKT、β-catenin表達(dá)在48 h較BMP9組低,較RFP組高,GSK-3β表達(dá)在48 h較BMP9組高,較RFP組低。說明骨肉瘤成骨分化是通過各種信號通路共同參與形成的平衡過程的過程,單一信號通路的抑制或者增加并不能對其產(chǎn)生作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738
【圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文30圖1 分別采用半定量RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測重組腺病毒AdsiId1轉(zhuǎn)入MG63 細(xì)胞后對 Id1 mRNA（A）及蛋白（B）表達(dá)水平的影響。(A)通過半定量 RT-PCR 在 mRNA 水平檢測 MG63 在感染 Ad-siId1、Ad-RFP72 h 后 Id1 的表達(dá)水平。（B）Western blot 在蛋白水平檢測 Id1 的表達(dá)。（Blank 組：MG63 細(xì)胞未做任何處理；AdRFP 組：重組腺病毒 Ad-RFP 感染的 MG63 細(xì)胞；AdsiId1 組：重組腺病毒 Ad-siId1 感染的 MG63 細(xì)胞）。β-actin 作為內(nèi)參。Fig.1 (A)The expression levels of Id1 mRNAs in MG63 cells 72 h after infection withrecombinant adenoviruses Ad-RFP, Ad-siId1 were detected by semi-quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction (RT-PCR).(B)The expression levels of Id1 protein inMG63 cells was deteced by Western blot.(Blank group: MG63 cells were not treated ; AdRFPgroup: MG63 cells were infected with adenovirus AdRFP; AdsiId1 group: MG63 cells wereinfected with Ad-siId1).β-actin was used as the internal control*P<0.05, vs the negativecontrol group (blank group and AdRFP group)(n=3).3.2 沉默 Id1 基因表達(dá)對 MG63 細(xì)胞凋亡率的影響Ad-RFP 和 Ad-siId1 轉(zhuǎn)入 MG63 細(xì)胞 72 h 后，F(xiàn)CM 法檢測結(jié)果（圖 2A）顯示，

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文AdsiId1 組的凋亡率為（20.1±0.12）%，明顯高于 AdRFP 組的（8.89±0.09）% 和空白對照組的（9.31±0.10）%（P 均＜ 0.05）。DAPI 染色法檢測結(jié)果（圖 2B）顯示，AdsiId 組發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對照組和 AdRFP 組（P 均＜0.05）。上述結(jié)果提示，沉默 Id1 基因表達(dá)可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞 MG63 的凋亡。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文FCM 法檢測結(jié)果（圖 3）顯示，AdsiId1 組細(xì)胞中 G1 期細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比為（87.05±1.17）%，明顯高于 AdRFP 組的（41.48±2.25）%及空白對照組的（32.37±2.17）%（P 值均＜0.05）。這一結(jié)果提示，抑制 Id1 的表達(dá)可以抑制骨肉瘤細(xì)胞由 G1 期進(jìn)入 S 期，從而抑制細(xì)胞增殖。

【參考文獻(xiàn)】

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1 羅光金;羅慶;畢楊;張璇;迭小紅;仇超;劉敏;康權(quán);;β-catenin協(xié)同BMP9誘導(dǎo)骨肉瘤TE85細(xì)胞成骨分化[J];腫瘤;2015年04期

2 王文娟;趙丹;徐靜;李麗;董謙;王玉鳳;馮巧靈;王錦;何娟文;何通川;羅進(jìn)勇;;雙氫青蒿素通過阻斷Wnt/β-catenin信號抑制骨肉瘤細(xì)胞系體外增殖和侵襲[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年08期

3 裴斐;張彤彤;張娜娟;楊超;楊春蕾;;沉默id1基因表達(dá)對食道癌細(xì)胞Eca-109生物學(xué)行為的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年03期

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1 仇超;Id1基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG63惡性逆轉(zhuǎn)向成骨分化的影響及作用機制[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號：2743531