【摘要】：目的:隨著現(xiàn)代社會大型交通工具發(fā)展,創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain inj ury,TBI)發(fā)生率逐漸增高,嚴(yán)重影響人們工作生活,社會影響巨大。最大限度地提高腦外傷后恢復(fù)的程度是神經(jīng)外科目前臨床工作努力地方向,因而探索腦創(chuàng)傷后神經(jīng)血管單元的修復(fù)機(jī)制一直是腦外傷研究的難點和重點。近期有研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元可以釋放并轉(zhuǎn)移受損的線粒體到神經(jīng)元周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)被進(jìn)一步處理。除此外也有報道星形膠質(zhì)細(xì)胞也可以釋放含有功能線粒體的囊泡進(jìn)入受損神經(jīng)元,促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)。但該項研究的研究者也同時表示,因為含有線粒體囊泡不僅含有DNA、RNA等遺傳物質(zhì),還含有某些重要蛋白質(zhì),所以該研究并不能完全證實線粒體本身單獨的作用。因此我們設(shè)計了本課題,用以研究純化后腦源性線粒體能否被某些腦內(nèi)細(xì)胞再次攝取并利用,從而改善受體細(xì)胞的能量代謝及其相應(yīng)功能,并且據(jù)此我們推測這種交換線粒體的能力可能代表著中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部細(xì)胞間能量傳遞的一種潛在模式。進(jìn)而為我們尋找腦創(chuàng)傷后神經(jīng)血管功能修復(fù)提供了一條嶄新的思路。方法:(1)我們采用國際通用且穩(wěn)定的膠質(zhì)細(xì)胞瘤化細(xì)胞系(C6)探索其可否釋放含有線粒體的囊泡,以及囊泡的功能。進(jìn)一步分離細(xì)胞系來源線粒體。(2)由于細(xì)胞系來源線粒體數(shù)量有限,我們利用新鮮鼠腦分離具有活性的正常功能線粒體,通過nanosight及流式細(xì)胞術(shù)鑒定其大小功能與數(shù)量;通過percol l濃度梯度離心方法獲得超純線粒體,接著透射電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)等方法觀察檢測線粒體形態(tài)特征以及濃度;應(yīng)用O2K、線粒體膜電位檢測儀鑒定純化線粒體功能及活性。(3)我們利用低氧培養(yǎng)箱建立神經(jīng)元損傷模型及腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,探討采用腦源性線粒體共孵育干預(yù)后,兩種細(xì)胞的活力以及氧耗等的變化。(4)通過本實驗室先進(jìn)的腦皮質(zhì)損傷儀(e CCI)來制備顱腦創(chuàng)傷小鼠模型。將純化線粒體注射到小鼠創(chuàng)傷灶區(qū)域,注射之后我們檢測血腦屏障伊文思藍(lán)的滲漏情況;應(yīng)用免疫組織化學(xué)熒光染色和western blot的方法檢測CCI小鼠創(chuàng)傷灶內(nèi)新生血管、細(xì)胞凋亡及血管內(nèi)皮緊密連接相關(guān)蛋白等的變化,檢測CCI小鼠長時程抑制(long-term depression,LTD)等改變,以及wester n blot技術(shù)揭示神經(jīng)元細(xì)胞GAP以及突出蛋白Ⅰ的表達(dá)變化情況,探究腦外傷后外源線粒體對小鼠認(rèn)知功能的影響。結(jié)果:采用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方式獲得純化線粒體的方案,由于得率較低,大批量培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致實驗過于繁瑣并且極易出現(xiàn)細(xì)胞污染或者細(xì)胞狀態(tài)不佳等,我們采用離體腦組織分離純化線粒體。并且成功的應(yīng)用percoll密度梯度離心的方法獲取超純線粒體,成功測得線粒體大小及濃度。通過透射電子顯微鏡、wester n blot的方法鑒定純化分離好的線粒體;利用熒光染料metotraker對線粒體進(jìn)行標(biāo)記,證實神經(jīng)元及內(nèi)皮細(xì)胞能夠攝入外源功能線粒體;體外實驗證實新鮮純化線粒體既能夠促進(jìn)損傷神經(jīng)元活力增加以及synaptophysinⅠ及GAP的表達(dá)增高又可以增加內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、OCLN表達(dá)增。體內(nèi)實驗證實新鮮純化線粒體既能夠降低創(chuàng)傷性顱腦損傷后血腦屏障的伊文氏藍(lán)滲透率以及腦水腫程度;又能夠改善創(chuàng)傷灶區(qū)海馬長時程抑制電生理學(xué)現(xiàn)象,從而改善CCI小鼠的認(rèn)知功能。結(jié)論:我們采用新鮮純化的線粒體改善腦外傷后神經(jīng)元以及內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝,改善神經(jīng)元的突觸可塑性,提高了腦外傷后的認(rèn)知功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部細(xì)胞之間存在通過轉(zhuǎn)移線粒體可以實現(xiàn)能量傳遞的機(jī)制。由于自身線粒體獲得相對容易,而且安全,相信通過進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究能夠為我們打開一扇通往腦外傷康復(fù)的大門。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15
【圖文】：

圖 1.1 觀察各指標(biāo)指示正常low-cell Top-plate，把組件和激光器一塊進(jìn)行組裝好，之后裝入好的樣品。圖 1.2 組裝組件和激光器osight 激光模塊放回主機(jī)的底座上。

組裝組件和激光器3）將nanosight激光模塊放回主機(jī)的底座上

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉艷華;王小中;;外泌體在疾病診療中的研究進(jìn)展[J];實驗與檢驗醫(yī)學(xué);2014年03期

本文編號：2739723