【摘要】：目的以小腸粘膜下層(SIS)和脫鈣骨基質(zhì)(DBM)為基材,制備組織誘導(dǎo)性可注射細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠,探究其制備過(guò)程和方法、成膠的理化性質(zhì)及水凝膠生物活性,并研究其體內(nèi)外的生物相容性和成骨成血管活性。方法采用不同方法制備SIS,分別應(yīng)用DNA含量、蛋白組學(xué)、掃描電鏡等方法檢測(cè)并比較三種方法對(duì)SIS脫細(xì)胞程度及成分、結(jié)構(gòu)的影響;采用改良Urist法制備DBM,并檢測(cè)其脫細(xì)胞程度和成分構(gòu)成;將SIS和DBM顆粒充分溶解于含胃蛋白酶的酸性溶液中制備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)溶液,通過(guò)調(diào)節(jié)p H和溫度使其自組裝形成合適濃度的SIS、DBM和SIS/DBM復(fù)合水凝膠材料。檢測(cè)水凝膠成膠動(dòng)力學(xué)和流變學(xué);掃描電鏡觀察水凝膠材料微觀形貌。將不同種類(lèi)的ECM水凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)共培養(yǎng),通過(guò)死活染色、CCK-8檢測(cè)水凝膠材料的細(xì)胞相容性和細(xì)胞增殖活性,通過(guò)茜素紅染色、ALP活性、成骨相關(guān)蛋白基因等方法檢測(cè)其成骨分化能力,RT-PCR檢測(cè)成血管相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平驗(yàn)證其成血管活性。將不同種類(lèi)的ECM水凝膠注射至大鼠背部皮下,設(shè)置組別為SIS組、DBM組、DBM/SIS組和ColⅠ組。在術(shù)后7天處死5只動(dòng)物,通過(guò)HE、Masson和CD31免疫組化染色檢測(cè)水凝膠材料的生物相容性、成血管活性;制備大鼠5mm顱骨缺損模型,設(shè)置組別為SIS組、DBM組、DBM/SIS組和ColⅠ組。分別在術(shù)后4周、8周各處死5只動(dòng)物,通過(guò)HE、Masson和免疫組化染色以及Micro CT檢測(cè)水凝膠材料誘導(dǎo)骨缺損再生修復(fù)能力。結(jié)果三種方法制備的SIS和DBM,行HE和DAPI染色均無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞核,殘存DNA含量分別為43.25 ng/mg、21.01 ng/mg、15.69 ng/mg和24.53 ng/mg ECM干重。ECM結(jié)構(gòu)在脫細(xì)胞之后均呈現(xiàn)出不同成分的破壞,可見(jiàn)膠原纖維排列凌亂,且有斷裂現(xiàn)象。蛋白組學(xué)顯示:SIS-1、SIS-2、SIS-3和DBM中檢測(cè)出的蛋白種類(lèi)分別為644、717、135和129種。以膠原蛋白的種類(lèi)最多,共有21個(gè)亞型,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、14、16型膠原蛋白,以Ⅰ型膠原的相對(duì)表達(dá)量最大。其中,Ⅳ、Ⅵ和14型膠原蛋白為SIS所特有,而Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ型膠原蛋白為DBM所特有。除膠原蛋白之外,纖維粘連蛋白(fibronectin)、蛋白多糖、VEGF、FGF、TGF-β和BMP-2也均檢測(cè)出表達(dá)。SIS與細(xì)胞共培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。將ECM溶解之后,通過(guò)調(diào)節(jié)p H和溫度,成膠動(dòng)力學(xué)顯示所有類(lèi)型的水凝膠均能在1h內(nèi)成膠,SIS/DBM復(fù)合凝膠成膠時(shí)間最短。流變學(xué)檢測(cè)顯示SIS、DBM和SIS/DBM凝膠材料的儲(chǔ)存模量分別為40.33±0.57 Pa、401.67±1.46 Pa和487±6.08 Pa。SEM顯示DBM和SIS/DBM凝膠材料呈現(xiàn)出納米膠原纖維交錯(cuò)分布,隨機(jī)排列,具有良好的孔隙率和三維支架結(jié)構(gòu),SIS凝膠為多孔結(jié)構(gòu),未見(jiàn)明顯納米纖維。死活染色提示水凝膠材料具有良好的細(xì)胞相容性。CCK-8提示水凝膠對(duì)于BMSCs增殖具有促進(jìn)作用。茜素紅染色和ALP活性檢測(cè)提示水凝膠材料能提高ALP活性并能促進(jìn)成骨分化,以DBM/SIS復(fù)合水凝膠最為顯著;RT-PCR結(jié)果顯示與SIS、SIS/DBM凝膠共培養(yǎng)的HUVEC表達(dá)KDR、Notch1和Ang2顯著高于DBM凝膠,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ECM水凝膠皮下注射實(shí)驗(yàn)顯示,所有ECM水凝膠均具有良好的注射性,HE、Masson染色可見(jiàn)SIS和DBM/SIS凝膠組新生血管較為明顯,且CD31免疫組化染色可見(jiàn)明顯的新生毛細(xì)血管分布;DBM組有少量新生血管,ColⅠ組未見(jiàn)血管形成,后兩者與前兩者有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;所有組別均未見(jiàn)明顯異位成骨跡象。大鼠顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中,Micro CT定量檢測(cè)結(jié)果顯示SIS、DBM、SIS/DBM和ColⅠ凝膠在4周和8周的BV/TV分別為29.2%、41.8%、66.32%和6.53%以及39.06%、56.5%、88.4%和8.9%。SIS/DBM復(fù)合凝膠的修復(fù)效果明顯好于其他三組,有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HE、Masson染色顯示SIS/DBM復(fù)合凝膠中可見(jiàn)明顯的新骨形成,DBM組次之,兩者均明顯強(qiáng)于SIS凝膠和ColⅠ凝膠,8周時(shí)修復(fù)效果明顯好于4周;ALP和OCN免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示SIS/DBM復(fù)合凝膠組和DBM凝膠中,ALP和OCN高度表達(dá),明顯高于SIS凝膠和ColⅠ水凝膠組。結(jié)論經(jīng)過(guò)適當(dāng)脫細(xì)胞方法制備的SIS和DBM,可保留其大部分天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)和活性成分。ECM酸溶液經(jīng)調(diào)節(jié)p H和溫度后可制備可注射水凝膠,具有良好的理化特性、生物相容性和成血管及成骨誘導(dǎo)活性,能原位誘導(dǎo)血管形成和新生骨形成,促進(jìn)骨缺損再生修復(fù),可作為一種良好的組織誘導(dǎo)性生物材料。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08;R68
【圖文】：

（1）配制濃度分別為 0、18.75、37.5、75、150、300ng/mL 的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品溶00μL。（2）從實(shí)驗(yàn) 4.1（9）中所得的 DNA 提取液中，提取 20μL 至 1.5mL 離心管中入 380μL 的 TE 溶液，充分吹打混勻。（3）取 37.5μL Picogreen 染液加入 10mL 離心管中，然后加入 7462.5μL 的 液，充分吹打混勻。（4）取 100μL DNA 溶液提取液放置酶標(biāo)板中，加入 100μL 稀釋后的 Picogr液，混合均勻后，避光反應(yīng) 5min，測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng) 480nm，發(fā)射波長(zhǎng)20nm）。. SIS 和 DBM 成分檢測(cè)應(yīng)用蛋白組學(xué)方法來(lái)分析三種方法制備的 SIS 和 DBM 含有的所有蛋白。采用記定量蛋白質(zhì)組學(xué)（label free）實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行所有樣品的檢測(cè)。具體操作步驟如.1 實(shí)驗(yàn)儀器和數(shù)據(jù)分析軟件

23圖 1-2 蛋白組學(xué)檢測(cè)使用的試劑和耗材驗(yàn)方法品制備方法用 TCA/丙酮沉淀+SDT 裂解法：取適量樣本在液氮中用磨碎成細(xì)粉狀的 TCA/丙酮（1:9），渦旋振蕩器混勻，置于-20℃冰箱中沉淀 4h 以上。 6000g 的轉(zhuǎn)速離心 40min，棄上清。加入預(yù)冷丙酮，洗滌三次。通風(fēng)櫥稱(chēng)取 30mg 干燥后的粉末，加入 30 倍體積（質(zhì)量體積比）的 SDT 裂解液淀，沸水浴 5 分鐘。使用超聲粉碎儀粉碎，再次沸水浴 15 分鐘。以 14心 15 分鐘。收集上清液過(guò)濾（0.22μm 濾膜）并收集濾液。蛋白質(zhì)定量

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 任廣鐵;周海宇;張蒼宇;拓振合;庾佳佳;孫瑞;趙琳;;組織工程骨膜及脫蛋白骨修復(fù)兔橈骨大段骨缺損的早期觀察[J];中國(guó)矯形外科雜志;2014年08期

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本文編號(hào)：2735548