發(fā)布時間：2020-06-30 16:40

【摘要】：目的以小腸粘膜下層(SIS)和脫鈣骨基質(zhì)(DBM)為基材,制備組織誘導性可注射細胞外基質(zhì)水凝膠,探究其制備過程和方法、成膠的理化性質(zhì)及水凝膠生物活性,并研究其體內(nèi)外的生物相容性和成骨成血管活性。方法采用不同方法制備SIS,分別應用DNA含量、蛋白組學、掃描電鏡等方法檢測并比較三種方法對SIS脫細胞程度及成分、結(jié)構(gòu)的影響;采用改良Urist法制備DBM,并檢測其脫細胞程度和成分構(gòu)成;將SIS和DBM顆粒充分溶解于含胃蛋白酶的酸性溶液中制備細胞外基質(zhì)(ECM)溶液,通過調(diào)節(jié)p H和溫度使其自組裝形成合適濃度的SIS、DBM和SIS/DBM復合水凝膠材料。檢測水凝膠成膠動力學和流變學;掃描電鏡觀察水凝膠材料微觀形貌。將不同種類的ECM水凝膠與骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)共培養(yǎng),通過死活染色、CCK-8檢測水凝膠材料的細胞相容性和細胞增殖活性,通過茜素紅染色、ALP活性、成骨相關蛋白基因等方法檢測其成骨分化能力,RT-PCR檢測成血管相關蛋白基因表達水平驗證其成血管活性。將不同種類的ECM水凝膠注射至大鼠背部皮下,設置組別為SIS組、DBM組、DBM/SIS組和ColⅠ組。在術(shù)后7天處死5只動物,通過HE、Masson和CD31免疫組化染色檢測水凝膠材料的生物相容性、成血管活性;制備大鼠5mm顱骨缺損模型,設置組別為SIS組、DBM組、DBM/SIS組和ColⅠ組。分別在術(shù)后4周、8周各處死5只動物,通過HE、Masson和免疫組化染色以及Micro CT檢測水凝膠材料誘導骨缺損再生修復能力。結(jié)果三種方法制備的SIS和DBM,行HE和DAPI染色均無肉眼可見的細胞核,殘存DNA含量分別為43.25 ng/mg、21.01 ng/mg、15.69 ng/mg和24.53 ng/mg ECM干重。ECM結(jié)構(gòu)在脫細胞之后均呈現(xiàn)出不同成分的破壞,可見膠原纖維排列凌亂,且有斷裂現(xiàn)象。蛋白組學顯示:SIS-1、SIS-2、SIS-3和DBM中檢測出的蛋白種類分別為644、717、135和129種。以膠原蛋白的種類最多,共有21個亞型,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、14、16型膠原蛋白,以Ⅰ型膠原的相對表達量最大。其中,Ⅳ、Ⅵ和14型膠原蛋白為SIS所特有,而Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ型膠原蛋白為DBM所特有。除膠原蛋白之外,纖維粘連蛋白(fibronectin)、蛋白多糖、VEGF、FGF、TGF-β和BMP-2也均檢測出表達。SIS與細胞共培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的細胞相容性。將ECM溶解之后,通過調(diào)節(jié)p H和溫度,成膠動力學顯示所有類型的水凝膠均能在1h內(nèi)成膠,SIS/DBM復合凝膠成膠時間最短。流變學檢測顯示SIS、DBM和SIS/DBM凝膠材料的儲存模量分別為40.33±0.57 Pa、401.67±1.46 Pa和487±6.08 Pa。SEM顯示DBM和SIS/DBM凝膠材料呈現(xiàn)出納米膠原纖維交錯分布,隨機排列,具有良好的孔隙率和三維支架結(jié)構(gòu),SIS凝膠為多孔結(jié)構(gòu),未見明顯納米纖維。死活染色提示水凝膠材料具有良好的細胞相容性。CCK-8提示水凝膠對于BMSCs增殖具有促進作用。茜素紅染色和ALP活性檢測提示水凝膠材料能提高ALP活性并能促進成骨分化,以DBM/SIS復合水凝膠最為顯著;RT-PCR結(jié)果顯示與SIS、SIS/DBM凝膠共培養(yǎng)的HUVEC表達KDR、Notch1和Ang2顯著高于DBM凝膠,具有統(tǒng)計學差異。ECM水凝膠皮下注射實驗顯示,所有ECM水凝膠均具有良好的注射性,HE、Masson染色可見SIS和DBM/SIS凝膠組新生血管較為明顯,且CD31免疫組化染色可見明顯的新生毛細血管分布;DBM組有少量新生血管,ColⅠ組未見血管形成,后兩者與前兩者有明顯的統(tǒng)計學差異;所有組別均未見明顯異位成骨跡象。大鼠顱骨缺損修復實驗中,Micro CT定量檢測結(jié)果顯示SIS、DBM、SIS/DBM和ColⅠ凝膠在4周和8周的BV/TV分別為29.2%、41.8%、66.32%和6.53%以及39.06%、56.5%、88.4%和8.9%。SIS/DBM復合凝膠的修復效果明顯好于其他三組,有顯著的統(tǒng)計學差異。HE、Masson染色顯示SIS/DBM復合凝膠中可見明顯的新骨形成,DBM組次之,兩者均明顯強于SIS凝膠和ColⅠ凝膠,8周時修復效果明顯好于4周;ALP和OCN免疫組織化學染色結(jié)果顯示SIS/DBM復合凝膠組和DBM凝膠中,ALP和OCN高度表達,明顯高于SIS凝膠和ColⅠ水凝膠組。結(jié)論經(jīng)過適當脫細胞方法制備的SIS和DBM,可保留其大部分天然細胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)和活性成分。ECM酸溶液經(jīng)調(diào)節(jié)p H和溫度后可制備可注射水凝膠,具有良好的理化特性、生物相容性和成血管及成骨誘導活性,能原位誘導血管形成和新生骨形成,促進骨缺損再生修復,可作為一種良好的組織誘導性生物材料。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R318.08;R68
【圖文】：

（1）配制濃度分別為 0、18.75、37.5、75、150、300ng/mL 的 DNA 標準品溶00μL。（2）從實驗 4.1（9）中所得的 DNA 提取液中，提取 20μL 至 1.5mL 離心管中入 380μL 的 TE 溶液，充分吹打混勻。（3）取 37.5μL Picogreen 染液加入 10mL 離心管中，然后加入 7462.5μL 的 液，充分吹打混勻。（4）取 100μL DNA 溶液提取液放置酶標板中，加入 100μL 稀釋后的 Picogr液，混合均勻后，避光反應 5min，測定熒光強度（激發(fā)波長 480nm，發(fā)射波長20nm）。. SIS 和 DBM 成分檢測應用蛋白組學方法來分析三種方法制備的 SIS 和 DBM 含有的所有蛋白。采用記定量蛋白質(zhì)組學（label free）實驗方法進行所有樣品的檢測。具體操作步驟如.1 實驗儀器和數(shù)據(jù)分析軟件

23圖 1-2 蛋白組學檢測使用的試劑和耗材驗方法品制備方法用 TCA/丙酮沉淀+SDT 裂解法：取適量樣本在液氮中用磨碎成細粉狀的 TCA/丙酮（1:9），渦旋振蕩器混勻，置于-20℃冰箱中沉淀 4h 以上。 6000g 的轉(zhuǎn)速離心 40min，棄上清。加入預冷丙酮，洗滌三次。通風櫥稱取 30mg 干燥后的粉末，加入 30 倍體積（質(zhì)量體積比）的 SDT 裂解液淀，沸水浴 5 分鐘。使用超聲粉碎儀粉碎，再次沸水浴 15 分鐘。以 14心 15 分鐘。收集上清液過濾（0.22μm 濾膜）并收集濾液。蛋白質(zhì)定量

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

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本文編號：2735548