發(fā)布時間：2020-06-29 16:37

【摘要】：研究目的:骨破壞相關(guān)活動可導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)生,這類疾病是一種退化性疾病,此類疾病的特征是破骨細(xì)胞的數(shù)量增加以及活動的增強(qiáng),進(jìn)而導(dǎo)致軟骨的下方骨質(zhì)的破壞喪失和軟骨的逐漸退化。通過將破骨細(xì)胞的分化增殖抑制,可以阻滯軟骨的下方骨的喪失,JNK信號通路通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的增殖以及功能來影響骨喪失類疾病的發(fā)生。JNK-IN-8作為被發(fā)現(xiàn)的第一種不可逆的JNK信號通路抑制劑,在本次研究中我們進(jìn)行一系列體內(nèi)及體外試驗(yàn)來評估其對破骨細(xì)胞的形成過程中增殖和分化的影響,以及對骨的保護(hù)以和對于骨關(guān)節(jié)炎的潛在的治療作用。研究方法:在體外實(shí)驗(yàn)中1.通過CCK-8法對不同濃度(0,0.125,0.25,0.5,1,2 μM)JNK-IN-8干預(yù)不同時間(48h)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行生存分析,尋找合理的藥物濃度;2.在體外利用RANKL誘導(dǎo)髓間充質(zhì)干細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞體系,通過TRAP染色進(jìn)行計數(shù)以及統(tǒng)計學(xué)評價JNK-IN-8對OCs形成和生存的影響。3.應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測JNK-IN-8對于RANKL誘導(dǎo)的BMMs細(xì)胞相關(guān)基因TRACP、CTR、NFACT、TAP、ACP5、CTSK的影響;4.應(yīng)用Western blot方法驗(yàn)證JNK-IN-8對于MAPK信號通路下游JNK信號通路下游的磷酸化的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中:1.建立c57小鼠的去卵巢骨質(zhì)疏松模型;2.將建模驗(yàn)證成功后的c57小鼠分為4組,分別是OVX對照組、JNK-IN-8刺激低劑量組、JNK-IN-8刺激高劑量組、唑來膦酸鹽刺激的sham組,進(jìn)行相應(yīng)處理。3兩月后取脛骨進(jìn)行Micro-CT掃描分析,應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)檢測脛骨。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.細(xì)通過胞生存分析我們發(fā)現(xiàn)藥物濃度為2 u M JNK-IN-8干預(yù)48h后抑制率約50%,(F=9.95,P0.01),本次試驗(yàn)中其他濃度的JNK-IN-8對于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)48h生存無明顯影響;2.通過TRAP染色發(fā)現(xiàn)0.25 μ M、0.5 μM和1 u M JNK-IN-8能顯著抑制體外RANKL誘導(dǎo)的OCs形成,1 μ M 能明顯抑制 OCs 生存(F=91.08,P0.01);3.Real-Time PCR 發(fā)現(xiàn) JNK-IN-8呈劑量依賴性抑制 RANKL 誘導(dǎo)的 TRACP、CTR、NFACT1、CTSK;4.Western blot檢測JNK-IN-8(1μM)抑制JNK磷酸化以及JNK-1/2/3,JNK-IN-8能顯著抑制JNK相關(guān)分子;5.對于c57小鼠OVX模型處理后發(fā)現(xiàn),JNK-IN-8能抑制去卵巢c57小鼠的骨質(zhì)疏松的進(jìn)展;6.對小鼠的骨組織應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)RANKL誘導(dǎo)而成的破骨細(xì)胞相關(guān)基因有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.JNK-IN-8能抑制體外RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞以及BMMSc分化形成破骨細(xì)胞,并抑制其破壞骨質(zhì)的能力。2.JNK-IN-8通過抑制JNK酸化,下調(diào)OCs相關(guān)基因表達(dá),抑制RANKL誘導(dǎo)的OCs活化。3.JNK-IN-8能抑制c57小鼠OVX模型中骨質(zhì)的吸收和骨質(zhì)疏松的發(fā)生。4.JNK-IN-8可作為潛在藥物被使用在的骨喪失相關(guān)疾病的抑制劑治療方案中。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681
【圖文】：

在藥物試驗(yàn)中，我們?yōu)榱伺懦驗(yàn)樗幬镒陨淼亩拘运a(chǎn)生的假陽性效果，研究了逡逑ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制劑０－２邋ｙ邋Ｍ濃度間對于破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞例如ＢＭＭｓ細(xì)胞以及逡逑ＲＡＷ２６４．邋７細(xì)胞在４８ｈ的毒性作用。由圖２可見ＪＮＫ－ＩＮ－８對于ＢＭＭｓ細(xì)胞及逡逑ＲＡＷ２６４．邋７細(xì)胞４８ｈ內(nèi)，只有在濃度為２邋ｙ邋Ｍ時細(xì)胞生存率在５０％（＊＊Ｐ〈邋０．邋０１）。逡逑１４逡逑

同時間內(nèi)表達(dá)量是下降的。為了進(jìn)一步證明ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制作用，ＢＭＭｓ細(xì)胞在不逡逑同濃度的ＪＮＫ－ＩＮ－８（（０，０．２５，邋１邋ｙＭ）下刺激相同的５天，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度提升，逡逑其分化后的生理活動相關(guān)基因表達(dá)量是下降的（圖４）。進(jìn)而說明了邋ＪＮＫ－ＩＮ－８逡逑抑制了邋ＲＡＭＬ誘導(dǎo)下的破骨細(xì)胞中破骨相關(guān)活動的目的基因的表達(dá)。這與前文中逡逑發(fā)現(xiàn)ＪＮＫ－ＩＮ－８抑制ＯＣｓ活性結(jié)果一致，揭示其機(jī)制可能并從基因水平提示其與抑逡逑制破骨細(xì)胞分泌表達(dá)的ＴＲＡＰ，邋ＣＴＳＫ，以及ＣＴＲ有關(guān)。逡逑ＴＩ＾ＡＰ邐ＣＴＲ邐ｋｆ邐ＣＴＳＫ逡逑Ｃ邋３８＾邐Ｃ逡逑ｆ邐｜邋ｆｌｉ邐ｉ逡逑｜＿ＣＷ邐Ｘ邐§邐~J邋Ｃｏｏ邐遂：邐ｇ邋你邋＿Ｃ0ｎ逡逑ｒ邋Ｉ邋ｉ邐１邐－邋╁義希桑澹

本文編號：2734087