【摘要】：椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration,IDD)是導(dǎo)致腰背痛及椎間盤源性腰痛的最常見原因,給患者個(gè)人家庭及社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。IDD的特征為椎間盤發(fā)生廣泛的形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)變化,椎間隙高度減低,椎間盤結(jié)構(gòu)破壞,脊柱活動(dòng)度下降,最終導(dǎo)致椎間盤生物力學(xué)功能喪失,同時(shí)引起下腰痛等臨床癥狀。椎間盤退變主要的生化改變?yōu)樽甸g盤內(nèi)軟骨樣髓核細(xì)胞出現(xiàn)變性及壞死,髓核細(xì)胞功能降低和數(shù)量減少,髓核細(xì)胞外基質(zhì)中II型膠原(Type II collagen,Col II)、蛋白聚糖等功能性基質(zhì)大分子丟失造成細(xì)胞賴以生存的環(huán)境被破壞。炎性介質(zhì)在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要的作用。炎癥因子在椎間盤退變過程中通過引起炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,破壞椎間盤的組織結(jié)構(gòu)。研究證明,TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(Interlukin-1β,IL-1β)、白介素 17(Interlukin-17,IL-17)、前列腺素E2(Prostaglandin GE2)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、一氧化氮(NO)等炎癥因子在椎間盤退變進(jìn)程中起重要作用。炎癥因子主要通過引起炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑,促進(jìn)椎間盤退變;同時(shí)椎間盤組織內(nèi)炎癥因子相互作用發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步加劇椎間盤組織的炎癥反應(yīng),加速椎間盤退變。IL-9最初被認(rèn)為是一種T淋巴細(xì)胞生長因子,主要由活化的CD4+Th9細(xì)胞分泌,此外肥大細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、其他淋巴細(xì)胞亞群也可以少量分泌。研究表明,IL9在炎癥反應(yīng)中能夠趨化炎癥細(xì)胞,促進(jìn)炎癥因子表達(dá),加劇炎癥反應(yīng)。目前,越來越多的證據(jù)表明Th9細(xì)胞和IL-9可能與人體炎癥反應(yīng)和自身免疫炎性疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。IL-9在多種自身免疫炎癥疾病,如哮喘、免疫性脊髓炎、骨性關(guān)節(jié)炎及炎癥性腸炎中發(fā)揮了重要作用。研究表明,IL-9可以促進(jìn)IL-4介導(dǎo)B細(xì)胞分化及IgE的表達(dá),此外IL-9還能夠促進(jìn)活化T細(xì)胞和肥大細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)過敏反癥的發(fā)生。IL-9作為一種細(xì)胞因子可以通過調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞的成熟和聚集,促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)T細(xì)胞趨化因子,從而促進(jìn)過敏性哮喘的發(fā)展。在自身免疫性炎性反應(yīng)方面,Nowak等在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中發(fā)現(xiàn),IL9能夠影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)IL-17A和IL-6的表達(dá)。體外試驗(yàn)證明,IL-9促進(jìn)股骨頭壞死患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)、釋放TNF-α、COX2等炎性因子,IL-9以濃度依賴和時(shí)間依賴方式促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌大量TNF-α、PGE2等炎癥因子,進(jìn)一步放大髖關(guān)節(jié)局部的免疫炎癥反應(yīng)。在退變椎間盤組織中,IL-9是否誘導(dǎo)髓核細(xì)胞TNF-α的表達(dá)及PGE2的產(chǎn)生,并通過二者發(fā)揮致炎作用,導(dǎo)致椎間盤內(nèi)炎癥反應(yīng),尚無明確研究。IL-9在椎間盤組織內(nèi)作用的具體作用機(jī)制也不明確本研究主要分為兩部分:第一部分主要探索IL-9及TNF-α在退變椎間盤的表達(dá)情況,明確IL-9及TNF-α是否參與椎間盤炎性退變的病理生理過程;第二部分主要通過體外實(shí)驗(yàn)探討IL-9調(diào)控退變髓核細(xì)胞分泌TNF-α和PGE2的影響,.進(jìn)一步明確IL-9的在椎間盤自身免疫炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制。第一部分:IL-9、TNF-α在退變椎間盤組織及血清表達(dá)的研究研究目的:椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)是導(dǎo)致腰背痛和腰椎間盤突出的最常見原因。近年來,突出或脫出的退變椎間盤組織所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)根炎性疼痛的觀點(diǎn)受到重視。前期研究表明輔助性T淋巴細(xì)胞9(Thelper 9,Th9)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-9在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。本研究通過檢測(cè)椎間盤突出患者椎間盤組織中IL-9和TNF-α的表達(dá),明確IL-9及TNF-α是否參與椎間盤炎性退變的病理生理過程。研究方法:選取2012年10月-2015年10月在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨外科住院、同時(shí)經(jīng)臨床表現(xiàn)、體格檢查和影像學(xué)檢查明確診斷為腰椎間盤突出癥患者。40例患單節(jié)段椎間盤突出癥病人的椎間盤組織以及5例脊柱外傷病人的椎間盤組織,根據(jù)影像學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)分為突出組(Group P)、脫出組(Group E)和正常對(duì)照組(Control Group)。免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)染色檢測(cè)各組退變椎間盤組織中IL-9和TNF-α的表達(dá),觀察上述指標(biāo)在各組退變椎間盤的表達(dá)變化及定位;蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)各組退變椎間盤組織IL-9和TNF-α蛋白表達(dá)水平;應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)觀察各組椎間盤組織中1L-9和TNF-αmRNA含量變化。收集患者外周血,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各組病人外周血血清中IL-9濃度水平。最后,根據(jù)各組退變椎間盤的Pfirrmann分級(jí)評(píng)分和IL-9血清濃度的變化進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。研究結(jié)果:首先,退變椎間盤組織IHC結(jié)果表明,突出組(Group P)和脫出組(Group E)退變椎間盤中有IL-9的表達(dá),脫出組(Group E)退變椎間盤組織中IL-9和TNF-α表達(dá)明顯高于突出組。Western blot結(jié)果同樣顯示脫出組(Group E)退變椎間盤組織中IL-9和TNF-α蛋白含量明顯較突出組(Group P)含量升高。Real-time PCR結(jié)果顯示脫出組(Group E)退變椎間盤組織中IL-9和TNF-αmRNA的表達(dá)含量與突出組(GroupP)相比顯著提高。ELISA結(jié)果顯示,與正常對(duì)照相比,突出組(Group P)和脫出組(Group E)病人外周血IL-9濃度水平明顯提高。最后,Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,各組退變椎間盤的Pfirrmann分級(jí)評(píng)分和IL-9血清濃度變化存在顯著性相關(guān)性。研究結(jié)論:IL-9和TNF-α可能是椎間盤退變自身免疫反應(yīng)過程中重要的致炎因子。IL-9無論在退變椎間盤組織中或外周血血清中均表達(dá)增多;外周血中IL-9分泌細(xì)胞趨化遷移至退變椎間盤組織局部炎癥部位,與椎間盤中的炎癥因子TNF-α共同相互作用,激活、級(jí)聯(lián)放大椎間盤組織的自身免疫反應(yīng),促進(jìn)椎間盤組織的進(jìn)一步退變。第二部分:IL-9對(duì)退變毮核細(xì)胞自身免疫炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究研究目的:腰椎間盤退變的自身免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制理論逐漸受到大多數(shù)學(xué)者的重視。椎間盤組織內(nèi)的髓核是人體最大的無血供組織,特殊的組織結(jié)構(gòu)使其成為機(jī)體的免疫豁免組織,椎間盤髓核組織突出后可激活局部強(qiáng)烈的自身免疫應(yīng)答,進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥發(fā)生并產(chǎn)生促炎因子級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)椎間盤退變。退變椎間盤組織中及外周血血清中IL9均表達(dá)X椂

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