【摘要】：第一部分創(chuàng)傷性腦損傷后Fos-like抗原1的表達及其意義背景與目的:神經(jīng)元凋亡是創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)化學(xué)信號級聯(lián)誘導(dǎo)繼發(fā)性腦損傷的重要過程,調(diào)控神經(jīng)元的凋亡是減輕顱腦創(chuàng)傷(Traumatic brain injuries,TBI)后機體運動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙重要途徑之一。Fos-like抗原1(Fra-1)是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族中的一員,轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物AP-1是在生物過程中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因素。作為AP-1家族成員之一,多個途徑匯聚在一起調(diào)控Fra-1的表達。Fra-1為整合多路徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供了一個動態(tài)平臺,將內(nèi)在或外部激活路徑連接在一起,通過刺激或參與這些過程中基因的表達,在細(xì)胞的運動、侵襲以及調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖中起著至關(guān)重要的作用。本部分研究的目的旨在明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Fra-1表達的定位,研究其在顱腦損傷模型中表達的變化,探討Fra-1對神經(jīng)元凋亡的影響及可能存在的調(diào)控機制。方法:1.在整體水平構(gòu)建CNS損傷模型,設(shè)定手術(shù)組、假手術(shù)組及對照組;2.分別在顱腦損傷后不同時間節(jié)點,運用Western blot測定Fra-1蛋白表達,分析其在此過程中的變化;3.免疫組化法及免疫熒光法確定Fra-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞的定位;4.分別在顱腦損傷后不同時間節(jié)點,采用Western blot測定蛋白表達,分析活化的Caspase-3在此過程中的變化;5.運用免疫熒光雙標(biāo)法研究Fra-1與活化的Caspase-3神經(jīng)元關(guān)系,探討Fra-1與神經(jīng)元凋亡存在的潛在聯(lián)系。結(jié)果:1.蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)Fra-1在損傷側(cè)大腦皮層的表達顯著增加,隨時間推移逐步升高,三天到達頂峰后逐步下降,14天后基本降至正常。假手術(shù)組及對照組Fra-1表達變化不明顯;2.免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)損傷三天后,大鼠皮層中的Fra-1陽性細(xì)胞顯著增加;3.免疫熒光雙標(biāo)提示Fra-1主要是與神經(jīng)元(Neure)在大腦皮層共同表達,在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達比較少。TBI 3d后大鼠皮層Fra-1陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加;4.腦損傷后大鼠腦皮層活化的Caspase-3的表達呈時間依賴性升高,并與Fra-1表達增加平行相關(guān);5.免疫熒光雙標(biāo)記法顯示,Fra-1與活化的Caspase-3共定位。結(jié)論:Fra-1主要定位于皮層神經(jīng)元。TBI后大鼠皮層Fra-1表達呈時間依賴性上調(diào),在損傷第3天達到峰值,后逐漸下降,28d后基本降至正常。TBI后,大鼠腦皮層活化的Caspase-3及P53的表達呈時間依賴性升高,并與Fra-1表達平行相關(guān)。Fra-1與活化的Caspase-3在皮層神經(jīng)元共定位。提示Fra-1與神經(jīng)元凋亡存在潛在聯(lián)系。第二部分Fos-like抗原1對創(chuàng)傷性腦損傷后皮層神經(jīng)元凋亡的影響及調(diào)控背景和目的:在第一部分的研究中發(fā)現(xiàn)Fra-1主要表達于大腦皮層的神經(jīng)元細(xì)胞中。顱腦損傷后神經(jīng)元細(xì)胞中Fra-1的表達明顯升高,與凋亡相關(guān)蛋白活化的Caspase-3表達呈正相關(guān)。由此表明Fra-1與神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。P53基因是一種抑癌基因,P53的激活可調(diào)控多種信號傳導(dǎo)通路,引起包括神經(jīng)元在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡。P53依賴性凋亡的激活可導(dǎo)致線粒體凋亡性的改變,最顯著的是細(xì)胞色素C的釋放和Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活,引起細(xì)胞死亡的發(fā)生。Fra-1作為一種原癌基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子與多條信號傳導(dǎo)通路有關(guān),顱腦損傷后Fra-1表達的升高通過何種機制激活P53傳導(dǎo)通路,從而調(diào)控神經(jīng)元的凋亡是我們進一步研究目標(biāo)。本部分旨在細(xì)胞水平上構(gòu)建顱腦損傷模型,進一步研究Fos-like抗原1與凋亡相關(guān)因素的關(guān)系,探討其對創(chuàng)傷性腦損傷后皮層神經(jīng)元凋亡可能存在的調(diào)控機制。方法:1.細(xì)胞水平上構(gòu)建過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型,分別在顱腦損傷后不同時間節(jié)點,運用Western blot分別測定Fra-1、Caspase-3及P53的蛋白表達,分析其在此過程中表達的變化;2.運用免疫熒光雙標(biāo)法研究Fra-1與活化的Caspase-3的定位關(guān)系,探討Fra-1與神經(jīng)元凋亡存在的潛在聯(lián)系;3.構(gòu)建靶向Fra-1的si RNA干擾Fra-1表達,Western blot分析活化的Caspase-3及P53表達的變化;4.流式細(xì)胞儀及Tunel法等分析這些干預(yù)對細(xì)胞凋亡的影響;5.細(xì)胞計數(shù)試劑盒評估干預(yù)前后細(xì)胞活力的變化。結(jié)果:1.蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)Fra-1在P12細(xì)胞損傷模型中的表達顯著增加,隨時間推移逐步升高,3h到達頂峰后逐步下降,12h后基本降至正常。2.細(xì)胞損傷后活化的Caspase-3及P53的表達呈時間依賴性升高,并與Fra-1表達的增加呈正相關(guān);3.免疫熒光雙標(biāo)提示Fra-1與活化的Caspase-3表達增加,且二者存在共定位關(guān)系;4.構(gòu)建4個獨立的si RNA靶向Fra-1,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Fra-1 si RNA 5′-CTCTGACCTACCCTCAGTA-3′對PC12細(xì)胞的Fra-1表達有明顯的干擾作用,可使Fra-1表達明顯下調(diào)。Western blot提示Fra-1表達下調(diào)后,活化的Caspase-3和P53的表達同步下降。5.Annexin-V/7-AAD凋亡分析和Tunel法顯示Fra-1表達的下調(diào)進一步降低細(xì)胞凋亡。6.細(xì)胞生存能力測量提示當(dāng)PC12細(xì)胞暴露于不同濃度的H2O2時,以劑量依賴性的方式降低了細(xì)胞的存活率。然而,Fra-1表達的下調(diào)顯著增加細(xì)胞的生存能力。結(jié)論:當(dāng)PC12細(xì)胞暴露于不同濃度的H2O2,時,以劑量依賴性的方式降低細(xì)胞存活率。20%,濃度的H2O2作為刺激最適劑量,且在刺激后3h達到細(xì)胞凋亡的最佳效果。si RNA 5′-CTCTGACCTACCCTCAGTA-3′可明顯干擾Fra-1表達。Fra-1在顱腦損傷后隨時間推移表達逐步上調(diào),P53及凋亡相關(guān)蛋白活化的Caspase-3表達的變化與之一致,在刺激3h達到峰值,后逐漸下降;Fra-1與活化的Caspase-3存在共定位關(guān)系。si RNA干擾Fra-1表達,顯著降低活化的Caspase-3和P53的表達,抑制細(xì)胞的凋亡,增強細(xì)胞的活性。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15
【圖文】：

圖 2 TBI 后大鼠皮層中 Fra-1 表達的變化：WB 檢測大鼠 TBI 模型中 Fra-1 蛋白表達變化：TBI 后大鼠從 1 天起明顯增加，3 天后達到峰值，然后逐漸恢復(fù)到正常水: 灰度分析統(tǒng)計結(jié)果，實驗相同條件下重復(fù) 3 次，*表示組間P<0.05)。

圖 4 免疫組化染色法檢測大鼠皮層中 Fra-1 的分布。A，D：假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)中 Fra-1 染色； B，E：TBI 后 3d 損傷對側(cè)大鼠腦皮質(zhì)中 Fra-1 染色；C，F(xiàn)：TBI 后 3d 大鼠損傷側(cè)腦皮質(zhì)中 Fra-1 染色。G:空白對照H：統(tǒng)計分析 Fra-1 陽性細(xì)胞， *表示與假手術(shù)及損傷對側(cè)相比，組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05)。圖 A，B，C 標(biāo)尺（Scale bar）=200μm，圖 D，E，F(xiàn) 標(biāo)尺（Scale bar=50μm。

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本文編號：2731358