【摘要】：目的:研究將NT-3基因修飾的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于樹枝狀兩親性肽凝膠內(nèi)部行三維培養(yǎng),大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化情況。方法:取4-6周SD大鼠無菌下分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并鑒定。以巨細(xì)胞病毒作為啟動(dòng)子,構(gòu)建1個(gè)攜帶NT-3基因的腺病毒載體即AdvNT-3,表達(dá)綠色熒光。以不同感染復(fù)數(shù)(MOI值)將AdvNT-3轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染2天后觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況確定最佳病毒感染復(fù)數(shù)。以AdvNT-3轉(zhuǎn)染大鼠骨髓干細(xì)胞即為NT-3-BMSC。1 wt%多肽溶液和細(xì)胞懸液混合,細(xì)胞分布于凝膠內(nèi)部形成三維培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)分三組,A組:BMSC二維培養(yǎng)組;B組:NT-3-BMSC二維培養(yǎng)組;C組:NT-3-BMSC+凝膠三維培養(yǎng)組;三組分別于體外培養(yǎng)7天后采用免疫熒光及qPCR檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2、β-III Tubulin的表達(dá)情況。結(jié)果:分離培養(yǎng)的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀鑒定為骨髓干細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48h后熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光表達(dá),且隨著MOI值增大熒光表達(dá)越強(qiáng)烈,MOI=100時(shí),熒光到達(dá)峰值,MOI為300時(shí),顯微鏡下觀察部分細(xì)胞死亡,因此最佳MOI為100。肽溶液在DMEM/F12觸發(fā)下形成三維凝膠,肉眼觀察呈透明凝膠狀,在電鏡下觀察可見凝膠呈成三維網(wǎng)狀纖維。免疫熒光結(jié)果顯示:A組MAP-2、β-III Tubulin表達(dá)陰性,B組及C組MAP-2、β-III Tubulin均表達(dá)陽(yáng)性,C組陽(yáng)性率高于B組。qRCR的結(jié)果和免疫熒光的結(jié)果相同,B組、C組的神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2、β-III Tubulin相對(duì)表達(dá)量均較A組升高,且C組的MAP-2、β-III Tubulin相對(duì)表達(dá)量均高于B組。因此經(jīng)過NT-3基因改性BMSCs在三維凝膠中培養(yǎng),能夠促進(jìn)細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,且三維培養(yǎng)優(yōu)于二維培養(yǎng)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R651.2
【圖文】：

12圖 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)第 3 代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原Figure 2: Detection of 3rd Generation BMSCs Surface Antigen by Flow Cytometry注：圖中 A 所示為 CD29 陽(yáng)性率 97.1%；B 為 CD44 陽(yáng)性率 99.8%；C 為 CD34 陽(yáng)性率 1.61 為 CD45 陽(yáng)性率 1.71%。

圖 3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂誘導(dǎo)分化能力Figure3:Rat bone marrow stem cells osteogenic, adipogenic differentiation3.4 病毒轉(zhuǎn)染最佳 MOI 值

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2725241