【摘要】：第一部分:人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及其向肌源性細(xì)胞分化的實驗研究研究目的研究人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord Wharton's Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物學(xué)特性及其向肌源性細(xì)胞分化的能力,并進(jìn)行攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的慢病毒轉(zhuǎn)染以獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP報告基因的hUCMSCs。研究方法收集新鮮健康足月產(chǎn)胎兒臍帶組織,將其放置于l×磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)溶液中反復(fù)沖洗,并清除臍帶內(nèi)的血管,留下華通氏膠組織。將其剪成lmm3大小的組織塊,采用II型膠原酶消化法從華通氏膠中分離得到hUCMSCs進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng),約10d后細(xì)胞達(dá)80%-90%的匯合度時傳代培養(yǎng),并觀察其細(xì)胞形態(tài)。取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activated cell sorting,FACS)檢測hUCMSCs免疫表型;應(yīng)用免疫熒光檢測多潛能干細(xì)胞標(biāo)記物Sox2、Oct4和Nanog的表達(dá);并在體外應(yīng)用5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-Aza)誘導(dǎo)其向肌源性細(xì)胞分化,用免疫熒光檢測骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)記物Pax-7和MyoD的表達(dá);用攜帶GFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs,應(yīng)用FACS分析其轉(zhuǎn)染率。研究結(jié)果采用II型膠原酶消化法獲得可貼壁生長的大量hUCMSCs,其能在體外被成功地進(jìn)行擴增培養(yǎng),原代培養(yǎng)hUCMSCs表現(xiàn)為上皮細(xì)胞樣或短成纖維細(xì)胞樣外,傳代后的hUCMSCs均表現(xiàn)為典型的長紡錘樣或成纖維樣細(xì)胞的形態(tài)。FACS結(jié)果顯示,hUCMSCs可高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)標(biāo)記物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而極低表達(dá)造血系標(biāo)記物CD14、CD34、CD45和HLA-II。免疫熒光染色結(jié)果顯示hUCMSCs能表達(dá)多潛能干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4和Sox2,但未見Nanog的表達(dá)。且在體外5-Aza誘導(dǎo)條件下表達(dá)骨骼肌干細(xì)胞標(biāo)記物Pax-7和MyoD。攜帶GFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)染后,hUCMSCs可以穩(wěn)定表達(dá)GFP,FACS分析顯示轉(zhuǎn)染率可達(dá)到50-70%,可獲得大量穩(wěn)定表達(dá)GFP基因的hUCMSCs。研究結(jié)論本研究證實了人臍帶華通氏膠中存在MSCs,且其具有向肌源性細(xì)胞分化的潛能。利用慢病毒轉(zhuǎn)染能獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP的hUCMSCs,從而為后期hUCMSCs移植療效的追蹤觀察奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。第二部分:人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞治療肌肉衰減綜合征的實驗研究研究目的采用人臍帶華通氏膠間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord Wharton's Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)移植治療肌肉衰減綜合征小鼠,觀察其是否有效并探討相關(guān)可能的作用機制。研究方法1.利用后肢懸提(hindlimb suspension,HLS)方法在32只老年雄性C57BL/6J小鼠(24月齡)建立肌肉衰減綜合征模型,HLS 2周后,所有的小鼠稱重,項部皮下埋入 25mg5-溴-2'-脫氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridinetablet,BrdU)緩釋片后恢復(fù)自由行動。2.根據(jù)是否接受干細(xì)胞移植治療及移植途徑不同將小鼠分為腓腸肌局部肌肉移植hUCMSCs(Muscular Transplant,MT)組、腓腸肌局部肌肉注射 PBS(MT-Con)組、尾靜脈移植 hUCMSCs(Tail Vein Transplant,TVT)組、尾靜脈注射PBS(TVT-Con)組,每組8只;hUCMSCs組每次給予0.1 ml含l×106個hUCMSCs的l×PBS,PBS組每次給予0.1 ml的l×PBS,移植治療所用的干細(xì)胞為傳代至5～6代的GFP標(biāo)記的hUCMSCs,每周1次,連續(xù)8周。3.療效評價:8周后水合氯醛麻醉,再次稱重,即刻分離雙側(cè)的腓腸肌并記錄濕重。比較hUCMSCs組和PBS組腓腸肌的絕對和經(jīng)體重標(biāo)化的相對濕重、肌纖維的橫截面積等指標(biāo)對hUCMSCs移植的療效進(jìn)行評價。4.機制探討:(1)利用熒光顯微鏡來觀察GFP標(biāo)記的hUCMSCs在腓腸肌內(nèi)的變化;(2)利用免疫熒光染色的方法分別對表達(dá)BrdU、Pax-7的細(xì)胞核進(jìn)行計數(shù)并計算它們的表達(dá)指數(shù);(3)利用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)對凋亡的細(xì)胞核進(jìn)行計數(shù)并計算凋亡指數(shù);(4)利用蛋白免疫印跡實驗(Westernblot)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELIS A)測定肌肉組織中炎性因子 TNF-α和IL-6,抗炎因子IL-4的表達(dá)。5.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示,采用雙向方差分析(two-wayANOVA)對不同移植方式(TVTvs.MT)和有無治療(hUCMSCsvs.PBS)進(jìn)行比較。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析(repeated-measures ANOVA)對 HLS 前和 HLS 后以及 hUCMSCs 治療后的縱向數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果1.hUCMSCs在肌肉衰減綜合征小鼠模型中的作用:HLS導(dǎo)致老年小鼠的體重平均下降13%左右,但與懸吊前相比無顯著性差別,四組間小鼠體重的下降也無顯著性差異(P0.05)。hUCMSCs移植8周后,體重仍繼續(xù)下降,hUCMSCs組小鼠下降小于其相應(yīng)PBS對照組,但無顯著性差異(P0.05)。hUCMSCs移植顯著增加腓腸肌的濕重和肌纖維的橫截面積(P0.01)。相對于TVT組,MT組腓腸肌濕重的增加更為明顯(P0.05)。2.(1)熒光顯微鏡下未找到GFP標(biāo)記的hUCMSCs;(2)BrdU、Pax-7的表達(dá)指數(shù):hUCMSCs移植可以顯著增加腓腸肌肌肉組織中BrdU和Pax-7陽性細(xì)胞指數(shù)(同對照組相比,MT組P0.001,TVT組P0.01),盡管這種增加在MT組更為明顯,但同TVT組相比,兩組間差別并無顯著意義(P0.05)。3.腓腸肌細(xì)胞核的凋亡指數(shù):hUCMSCs移植可以顯著減少腓腸肌肌肉組織中凋亡細(xì)胞指數(shù)(同對照組相比,MT組P0.001,TVT組P0.01),盡管這種減少在MT組更為明顯,但同TVT組相比,兩組間差別并無顯著意義(P0.05)。4.肌肉組織炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子的含量:不論是TVT組還是MT組,hUCMSCs移植能顯著減少HLS后老年C57BL/6J小鼠腓腸肌肌肉組織炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá),增加抗炎因子IL-4的表達(dá)。研究結(jié)論1.hUCMSCs移植顯著改善老年小鼠腓腸肌的濕重及肌纖維的橫截面積,hUCMSCs移植能有效治療肌肉衰減綜合征。2.hUCMSCs移植有效治療肌肉衰減綜合征的作用機制可能通過激活骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞、減少細(xì)胞核凋亡和減輕慢性炎癥反應(yīng)促進(jìn)老年骨骼肌纖維的增生。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R685
【圖文】：

圖１．倒置顯微鏡下原代（Ｐ０）及傳代至第５邋（Ｐ５）及第１０代（Ｐ１０）生長至第５逡逑

圖２．邋ＦＡＣＳ檢測ｈＵＣＭＳＣｓ表面標(biāo)記物的表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】

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1 周仙杰;李軍;魯飛翔;胡南;劉慶春;;肌肉衰減綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)及診斷指標(biāo)測量方法研究進(jìn)展[J];山東醫(yī)藥;2016年27期

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本文編號：2716417