【摘要】：實驗?zāi)康?研究機(jī)械牽張應(yīng)力模型中骨肉瘤細(xì)胞中Piezo1表達(dá)的變化,并探究shRNA-Piezo1下調(diào)Piezo1的表達(dá)后對骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。實驗方法:構(gòu)建沉默Piezo1表達(dá)的慢病毒,轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的骨肉瘤MG63和U2細(xì)胞株;將實驗分為空白對照組(無慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞),陰性對照組(無序序列質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞)和ShPiezo1組(shRNA Piezo1干擾序列質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞);利用Flexcell細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)構(gòu)建體外機(jī)械牽張應(yīng)力的細(xì)胞模型(根據(jù)預(yù)實驗設(shè)0h、2h、12h、24h、48h機(jī)械牽張應(yīng)力組);用Western-blot和RT-qPCR檢測骨肉瘤細(xì)胞中Piezo1的表達(dá)量;通過免疫熒光對Piezo1蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行定位檢測;用CCK-8法檢測骨肉瘤細(xì)胞的增殖情況;用AV-PI凋亡試劑盒檢測骨肉瘤細(xì)胞的凋亡情況。實驗結(jié)果:(1)成功包裝慢病毒載體,并成功轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG63和U2細(xì)胞株,RT-qPCR和Western-blot檢測結(jié)果顯示:骨肉瘤兩種細(xì)胞株中Piezo1表達(dá)無明顯差異,選用MG63型細(xì)胞株作為本實驗所用細(xì)胞。(2)RT-qPCR檢測結(jié)果顯示:Piezo1在加載不同時間的機(jī)械牽張應(yīng)力下的骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)不同,在24h機(jī)械牽張應(yīng)力下表達(dá)量最高(P0.05)。ShPiezo1組細(xì)胞,Piezo1的表達(dá)較空白對照組均有所下降(P0.05)。(3)Western-blot結(jié)果顯示:Piezo1蛋白在加載不同時間的機(jī)械牽張應(yīng)力下的骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)不同,在24h機(jī)械牽張應(yīng)力下表達(dá)量最高(P0.05)。ShPiezo1組細(xì)胞,Piezo1蛋白均無明顯表達(dá)。(4)免疫熒光結(jié)果顯示:空白對照組中Piezo1蛋白在骨肉瘤細(xì)胞膜上表達(dá),ShPiezo1組骨肉瘤細(xì)胞Piezo1蛋白的表達(dá)明顯低于空白對照組。(5)CCK-8實驗結(jié)果顯示:對骨肉瘤細(xì)胞加載不同時間的機(jī)械牽張應(yīng)力,會影響細(xì)胞的增殖率。在加載24h機(jī)械牽張應(yīng)力后,骨肉瘤細(xì)胞增殖率最低(P0.05)。ShPiezo1組細(xì)胞,骨肉瘤細(xì)胞的增殖率在12h、24h、48h機(jī)械牽張應(yīng)力后較空白對照組顯著增高(P0.05)。(6)AV-PI實驗結(jié)果顯示:不同時間的機(jī)械牽張應(yīng)力會影響骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率。骨肉瘤細(xì)胞在加載2h機(jī)械牽張應(yīng)力后,細(xì)胞早期凋亡率最高(P0.05),在加載24h機(jī)械牽張應(yīng)力后細(xì)胞晚期凋亡率最高(P0.05),并且總的凋亡率也是最高(P0.05)。ShPiezo1組細(xì)胞,在加載12h、24h、48h機(jī)械牽張應(yīng)力后,細(xì)胞晚期凋亡率和總凋亡率出現(xiàn)下降(P0.05)。結(jié)論:體外實驗機(jī)械敏感性離子通道Piezo1蛋白能在人骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá),Piezo1能抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1
【圖文】：

圖 1 A LV3 慢病毒載體構(gòu)建模式圖；B、C 質(zhì)粒構(gòu)建模式圖；D、在 0.11μL 和 0.033μL 陰性對照的病毒滴度（100×）；E、在 0.11μL 和 0.033μLPiezo1-shRNA 組的病毒滴度（100×）. 骨肉瘤細(xì)胞中 Piezo1 的 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平.1.骨肉瘤 MG63、U2 細(xì)胞中 Piezo1 的表達(dá)及有效 Piezo1-shRNA 慢病毒載體的篩選結(jié)檢測結(jié)果分別為 LV3-Piezo1-homo-2844，LV3-Piezo1-homo-3201，LV3-Piezo1-omo-4155 和陰性序列對照組（圖 2）。RT-PCR（圖 2B）結(jié)果顯示：骨肉瘤細(xì)胞 MG63、 U2 組中的各轉(zhuǎn)染組的 Piezo1 表達(dá)無明顯差異，骨肉瘤細(xì)胞 MG63 組、 U2 組中通 LV3-PIEZO1-homo-3201 慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞 Piezo1 的表達(dá)量最低。

寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 結(jié)果- 22 -圖3 空白對照組和ShPiezo1組的RT-qPCR、western-blot的檢測結(jié)果A. 空白對照組和ShPiezo1組的RT-qPCR檢測結(jié)果；B. 空白對照組和ShPiezo1組的Western-Blot的檢測結(jié)果；C.Image J 軟件分析Western-Blot蛋白條帶的灰度值注：n.s.表示P ＞0.05；* 表示P＜0.05；** 表示P＜0

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本文編號：2712920