【摘要】：第一部分絕經(jīng)后脆性骨折患者“鐵代謝”與“骨代謝”指標(biāo)的臨床相關(guān)性觀察目的:觀察絕經(jīng)后髖部脆性骨折患者血清鐵蛋白、骨鐵含量與骨密度(髖部、腰椎)、骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的臨床相關(guān)性。方法:回顧性分析2014年01月至2017年05月,因髖部脆性骨折(股骨頸骨折)入我院行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的304例絕經(jīng)后女性患者臨床指標(biāo),所有患者均知情同意。手術(shù)過程中收集股骨頭標(biāo)本進(jìn)行骨鐵含量檢測。所有患者術(shù)前1天收集血清并檢測相關(guān)指標(biāo),術(shù)后7天健側(cè)髖部及腰椎檢測骨密度。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)多發(fā)骨折(n=6);(2)慢性肝臟疾病(n=2);(3)糖尿病及甲狀腺相關(guān)疾病(n=31);(4)術(shù)后感染(n=4);(5)雙膦酸鹽應(yīng)用史(n=1)。最終納入260例患者,相關(guān)臨床資料行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:血清鐵代謝(鐵蛋白Fer、骨鐵Bone iron、轉(zhuǎn)鐵蛋白TRF、血清鐵離子Fe)指標(biāo)繪制矩陣圖,其中鐵蛋白與骨鐵兩兩相關(guān)性最強,呈顯著正相關(guān)。單因素Pearson相關(guān)分析觀察所有臨床指標(biāo)與骨鐵相關(guān)性,僅鐵蛋白呈正相關(guān)(r=0.696,p=0.000)。Pearson相關(guān)分析觀察臨床指標(biāo)與髖部及腰椎骨密度(BMD)相關(guān)性,其中,年齡、Fer、骨鐵、BMI、TRF與BMD存在顯著相關(guān)性,其中年齡、Fer、骨鐵、BMI能納入髖部BMD多元線性回歸方程,年齡、Fer、骨鐵能納入腰椎BMD多元線性回歸方程。控制年齡、Fer及BMI,對骨鐵行骨密度偏相關(guān)分析,結(jié)果顯示骨鐵與髖部及腰椎BMD均存在明顯負(fù)相關(guān)性。對年齡、骨鐵及骨密度三者繪制三維散點及mesh圖,以等值線圖作為結(jié)果表示:隨著骨鐵水平和年齡的上升,髖部及腰椎骨密度明顯減少。根據(jù)WHO關(guān)于骨質(zhì)疏松癥(OP)的診斷標(biāo)準(zhǔn),把260例骨折患者分為兩組:骨質(zhì)疏松組與非骨松組,將OP的診斷作為因變量,骨鐵作為自變量繪制受試者工作特征曲線(ROC),曲線下面積AUC=0.790(p0.05),截斷點骨鐵為139.7μg/g。以骨鐵139.7μg/g作為界值將該部分人群分為高骨鐵組與低骨鐵組,比值比OR=12.143(95%CI=5.406—27.777),高骨鐵患者的骨質(zhì)疏松發(fā)病風(fēng)險為低骨鐵患者的12.143倍。Peason相關(guān)分析觀察骨鐵與骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(BTMs)相關(guān)性,結(jié)果提示骨鐵與骨吸收指標(biāo)(TRAP-5b、β-CTX)存在明顯正相關(guān)(r=0.202,0.209;p=0.012,0.009)。結(jié)論:骨鐵指標(biāo)與血清鐵蛋白有相關(guān)性,在對骨折創(chuàng)傷患者鐵代謝水平的診斷中具有一定價值。女性骨量下降的獨立危險因素可能包括高濃度的骨鐵。骨鐵含量的升高影響骨量的現(xiàn)象可能涉及骨吸收的過程。第二部分鐵蓄積對小鼠骨質(zhì)疏松模型中骨代謝、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性的影響目的:研究鐵劑干預(yù)后,正常小鼠與卵巢切除骨質(zhì)疏松模型小鼠骨量、骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)、成骨及破骨細(xì)胞相關(guān)功能的改變。方法:對第一部分臨床結(jié)論進(jìn)行基礎(chǔ)實驗的初步模擬。1、動物實驗:3月齡ICR雌性小鼠隨機分為4組(con組、OVX組、F組、F+OVX組),前兩組注射NS,余兩組注射等量枸櫞酸鐵胺(FAC),con及F組為假手術(shù)組,余組切除雙側(cè)卵巢。4周后檢測小鼠體重。肝臟、骨組織行普魯士藍(lán)鐵染色,股骨Micro-CT進(jìn)行三維掃描。血清Fer、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(osteocalcin)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP-5b)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)觀察。小鼠沖出骨髓,細(xì)胞懸液添加巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)及核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞,TRAP染色計數(shù)陽性細(xì)胞。2、細(xì)胞實驗:(1)New-born小鼠分離顱骨,胰酶梯度消化抽提原代成骨細(xì)胞,分為對照組、E2組、FAC組、FAC+E2組,其中FAC濃度為10μM,雌二醇濃度為10n M,3天行ALP染色,14天行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色。熒光定量PCR(q-PCR)觀察成骨相關(guān)基因(RUNX2、SP7、BGLAP)表達(dá)。(2)RAW264.7分組同上,添加RANKL向破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo),分化程度采用TRAP染色分析,鏡下觀察DCFH-DA干預(yù)后成骨及破骨細(xì)胞活性氧(ROS)熒光強度。破骨相關(guān)基因(TRAP5、CTSK、MMP9、CALCR)表達(dá)采用q-PCR分析。結(jié)果:1、在體研究:各組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。干預(yù)結(jié)束后F組、F+OVX組血清Fer水平顯著上升(p0.05),肝臟及股骨遠(yuǎn)端普魯士藍(lán)鐵沉積顯著。Micro-CT結(jié)果顯示:雌激素水平正常,鐵蓄積不能影響骨密度;當(dāng)卵巢切除后,鐵蓄積組骨量下降更為顯著。血清蛋白ELISA結(jié)果表明:正常雌激素水平小鼠(F組)相較于對照組,骨吸收指標(biāo)(TRAP-5b、CTX)及氧化應(yīng)激指標(biāo)(MDA、SOD)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,組間TRAP染色原代破骨細(xì)胞計數(shù)無顯著差異,F組骨形成指標(biāo)(ALP、osteocalcin)較對照組下降;雌激素缺乏后,鐵蓄積能顯著上升MDA及骨吸收指標(biāo)水平,并下調(diào)骨形成指標(biāo)及SOD,且破骨細(xì)胞數(shù)顯著高于卵巢切除組(p0.05)。2、離體研究:(1)成骨細(xì)胞,ALP活性、成骨相關(guān)基因表達(dá)均被鐵劑抑制。(2)RAW264.7細(xì)胞TRAP染色結(jié)果示:鐵劑干預(yù)后破骨樣細(xì)胞數(shù)明顯增加,在雌激素預(yù)干預(yù)時,E2組與FAC+E2組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異。DCFH-DA檢測結(jié)果:鐵劑能顯著上調(diào)成骨及破骨細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平(p0.05)。q-PCR結(jié)果:FAC顯著增加TRAP-5、CTSK、MMP9、CALCR表達(dá)水平,雌激素預(yù)干預(yù)后,該上調(diào)作用被抑制。結(jié)論:雌激素水平正常時,鐵蓄積對骨代謝無明顯影響。雌激素缺乏時,鐵蓄積促進(jìn)骨量下降,該過程與骨吸收、破骨活性上調(diào)相關(guān),ROS水平可能調(diào)控該過程。第三部分骨質(zhì)疏松模型小鼠鐵劑干預(yù)后不同時間骨代謝相關(guān)指標(biāo)的變化目的:觀察鐵劑干預(yù)的不同時間點,骨質(zhì)疏松模型小鼠骨量、骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)、成骨及破骨細(xì)胞相關(guān)功能的改變。方法:根據(jù)第二部分結(jié)論,隨機將12周齡的雌性ICR小鼠分為E+F-組、E-F-組、E-F+組,E-F-組、E-F+組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。E+F-組及E-F-組注射NS,余組注射等量FAC,干預(yù)4周,各組每周處死6只小鼠,收集所有小鼠血清進(jìn)行細(xì)胞實驗。檢測小鼠體重。股骨遠(yuǎn)端行Micro-CT三維重建。ELISA檢測血清Fer、ALP、osteocalcin、CTX、TRAP-5b、MDA及SOD。提取所有小鼠股骨及脛骨中骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞誘導(dǎo),TRAP染色觀察破骨細(xì)胞分化并計數(shù)。提取新生小鼠原代成骨細(xì)胞,以收集的小鼠血清進(jìn)行培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)所用的小鼠血清分為相應(yīng)的三組,3天行ALP染色,14天行茜素紅染色。結(jié)果:FAC干預(yù)一周血清Fer即有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。在FAC干預(yù)過程中,血清骨形成相關(guān)指標(biāo)ALP、osteocalcin于最后一周出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。TRAP-5b、CTX分別于第3周、第2周出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。SOD在FAC干預(yù)第2周時下降(p0.05),MDA在第1周時上調(diào)(p0.05)。Micro-CT結(jié)果顯示:BMD于第4周出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);三維重建及其余參數(shù)均符合該結(jié)果。TRAP染色示:鐵劑干預(yù)第2周破骨細(xì)胞分化增強,第4周達(dá)到峰值。ALP染色示:FAC干預(yù)第2周明顯抑制成骨細(xì)胞活性。鈣結(jié)節(jié)染色提示:第3周鈣結(jié)節(jié)礦化受明顯抑制。結(jié)論:鐵蓄積首先影響活性氧水平(1-2周),繼而影響破骨細(xì)胞分化(2周)及骨吸收(2-3周),再影響成骨細(xì)胞礦化(3周)及骨形成(4周),最終影響骨量(4周)。各組所有指標(biāo)均于第4周出現(xiàn)最大差異。第四部分MAPK及NF-κB信號通路在“鐵蓄積增強破骨細(xì)胞活性”中的作用目的:觀察高鐵環(huán)境下,MAPK及NF-κB信號通路相關(guān)指標(biāo)在骨組織及破骨細(xì)胞中的改變,并探討氧化應(yīng)激在其中的作用。方法:收集第三部分實驗中,所有第4周的標(biāo)本。骨組織切片行HE染色及破骨細(xì)胞TRAP染色。骨組織提取RNA及蛋白,檢測成骨、破骨相關(guān)基因及蛋白表達(dá),同時檢測氧化應(yīng)激蛋白(GSH-Px)水平。提取并誘導(dǎo)原代破骨細(xì)胞,TRAP染色計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),DCFH-DA檢測胞內(nèi)ROS水平。骨組織蛋白檢測MAPK(ERK1/2、p38、JNK及相應(yīng)磷酸化蛋白)及NF-κB(胞核P50、P65及胞漿IκBα)信號通路蛋白。取E-F-組、E-F+組原代破骨細(xì)胞,在E-F+組基礎(chǔ)上干預(yù)MAPK通路抑制劑和NF-κB通路抑制劑,并檢測對應(yīng)蛋白表達(dá)及破骨細(xì)胞分化情況。凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)分析二聚體蛋白和DNA的結(jié)合程度。對E-F-組細(xì)胞進(jìn)行H2O2干預(yù),并以BAY11-7082抑制NF-κB通路,檢測三組細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)、破骨細(xì)胞分化、蝕骨能力及DNA與NF-κB結(jié)合能力。對E-F-組、E-F+組小鼠干預(yù)狄諾塞麥(Damb),Micro-CT三維重建,提取并誘導(dǎo)原代破骨細(xì)胞,TRAP染色計數(shù),Western blot檢測骨組織RANKL蛋白表達(dá)。結(jié)果:q-PCR結(jié)果提示:第4周鐵蓄積顯著上調(diào)破骨相關(guān)基因表達(dá)(p0.05)。破骨相關(guān)蛋白TRAP及Cathepsin K表達(dá)水平在高鐵環(huán)境中也顯著上升(p0.05)。而FAC對成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)無明顯影響。鐵蓄積明顯下調(diào)骨組織中GSH-Px表達(dá)。HE染色表明:卵巢切除后骨小梁明顯稀疏,FAC干預(yù)后骨小梁間隙進(jìn)一步增大。骨組織及原代破骨細(xì)胞TRAP染色提示:鐵劑干預(yù)后,骨組織破骨細(xì)胞數(shù)明顯增加。DCFH-DA熒光提示:鐵劑干預(yù)明顯增強破骨細(xì)胞胞內(nèi)ROS熒光數(shù)量及強度。骨組織Western blot結(jié)果:MAPK信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果表明,ERK及JNK信號通路被FAC明顯激活,而p38信號通路在高鐵環(huán)境下無明顯改變(p0.05)。NF-κB信號通路相關(guān)蛋白檢測結(jié)果表明,FAC顯著激活核內(nèi)P65/P50二聚體表達(dá)。對高鐵環(huán)境下原代破骨細(xì)胞進(jìn)行MAPK通路抑制,破骨細(xì)胞分化無明顯差異,q-PCR結(jié)果與TRAP染色結(jié)果一致。對高鐵環(huán)境下原代破骨細(xì)胞進(jìn)行NF-κB通路抑制,破骨細(xì)胞TRAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降(p0.05)。EMSA結(jié)果示:NF-κB與DNA結(jié)合能力下降。H2O2干預(yù)后,破骨細(xì)胞GSH-Px表達(dá)下降,IKKα表達(dá)上升,破骨細(xì)胞分化能力增強,NF-κB通路抑制后,IKKα表達(dá)水平下降,破骨細(xì)胞分化能力及蝕骨活性減弱。E-F-組、E-F+組Damb干預(yù)后,相較于E-F-組、E-F+組,骨量恢復(fù)明顯,破骨細(xì)胞分化明顯抑制,組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:鐵蓄積對破骨細(xì)胞的分化增強作用與ROS上調(diào),并進(jìn)一步激活NF-κB信號通路有關(guān),與MAPK信號通路無關(guān)。IKKs蛋白可能是鐵影響骨吸收的上游靶點。
【圖文】：

鐵代謝指標(biāo)（Fer、Boneiron、TRF、Fe）矩陣圖

26圖 2 骨密度 T 值隨年齡、鐵蛋白、骨鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白及 BMI 變化趨勢（A-B.腰椎及髖部 TRC-D.腰椎及髖部 BMI；E-F.腰椎及髖部骨鐵；G-H.腰椎及髖部年齡；I-J.腰椎及髖部 Fer）A B
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R683

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10 沈曉o，

本文編號：2710885