【摘要】：目的:1、探索不同強(qiáng)度的機(jī)械應(yīng)力刺激對大鼠軟骨細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞活性和軟骨表型等的影響。2、探究初級纖毛和自噬在軟骨細(xì)胞發(fā)育過程中的定位表達(dá)和調(diào)控關(guān)系。3、探究機(jī)械應(yīng)力刺激對初級纖毛和自噬交互作用的影響及ERK-m TOR信號軸在此調(diào)控過程中的作用。4、探討多磷酸肌醇5磷酸酶E(INPP5E)在應(yīng)力介導(dǎo)的初級纖毛和自噬交互調(diào)控中的作用。方法:1、體外分離培養(yǎng)新生大鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,通過四點(diǎn)彎曲應(yīng)力系統(tǒng)對軟骨細(xì)胞施加不同強(qiáng)度(1000μstrain、2500μstrain、4000μstrain;1Hz;2h)的周期性應(yīng)力刺激,通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA和表型相關(guān)蛋白COL II表達(dá);RT-PCR檢測表型相關(guān)基因COL II和SOX9表達(dá);Live/dead檢測細(xì)胞活性變化情況。2、通過透射電鏡、免疫熒光雙標(biāo)染色等觀察初級纖毛和自噬在軟骨細(xì)胞發(fā)育過程中的定位表達(dá)情況;分別使用無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)纖毛,水合氯醛破壞纖毛,雷帕霉素(Rapamycin)以及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)分別激活和抑制自噬,再以免疫熒光雙標(biāo)染色和Western blot等實(shí)驗(yàn)探究初級纖毛和自噬的表達(dá)關(guān)聯(lián)性及相關(guān)蛋白功能的調(diào)控關(guān)系。3、通過四點(diǎn)彎曲應(yīng)力系統(tǒng)給予軟骨細(xì)胞不同強(qiáng)度的應(yīng)力刺激(1000μstrain、2500μstrain、4000μstrain),免疫熒光染色和Western blot等實(shí)驗(yàn)分別檢測軟骨細(xì)胞初級纖毛發(fā)生率、長度及功能蛋白IFT88的表達(dá),以及軟骨細(xì)胞自噬水平及自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1的表達(dá)。用水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后,再通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測2500μstrain的應(yīng)力刺激對初級纖毛和自噬相關(guān)蛋白交互調(diào)控的影響,并檢測ERK-m TOR信號軸相關(guān)P-ERK、P-m TOR蛋白的表達(dá)情況。4、體外給予軟骨細(xì)胞不同強(qiáng)度的應(yīng)力刺激,Western blot檢測INPP5E蛋白的表達(dá)情況;再通過構(gòu)建并轉(zhuǎn)染INPP5E的小分子干擾RNA,RT-PCR、Western blot驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率,免疫熒光染色檢測初級纖毛和自噬的表達(dá)情況;再在轉(zhuǎn)染INPP5E si RNA后給予2500μstrain的應(yīng)力刺激,檢測下調(diào)INPP5E后應(yīng)力刺激對IFT88、LC3、Cyclin D1、COL II蛋白表達(dá)的影響,同時動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證運(yùn)動訓(xùn)練對骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)分泌和IFT88、LC3B、INPP5E蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1、中低強(qiáng)度的應(yīng)力刺激(1000和2500μstrain)能上調(diào)Cyclin D1、PCNA的表達(dá),而高強(qiáng)度應(yīng)力刺激(4000μstrain)則作用不明顯;中低強(qiáng)度的應(yīng)力刺激對軟骨細(xì)胞的活性沒有明顯影響,而高強(qiáng)度應(yīng)力刺激后凋亡的軟骨細(xì)胞數(shù)量增多。同樣的,中低強(qiáng)度的應(yīng)力刺激上調(diào)表型相關(guān)基因COL II、SOX9和COL II蛋白的表達(dá),而高強(qiáng)度刺激則呈抑制效應(yīng)。2、正常軟骨細(xì)胞中存在初級纖毛和自噬的共表達(dá),并且二者在軟骨細(xì)胞周期中存在一定的定位表達(dá)關(guān)系,無血清饑餓可同時誘導(dǎo)初級纖毛、自噬及其蛋白的表達(dá),水合氯醛抑制纖毛的同時下調(diào)自噬及其蛋白表達(dá),雷帕霉素在激活自噬的同時上調(diào)IFT88蛋白的表達(dá),而3-甲基腺嘌呤抑制自噬的同時減少初級纖毛的發(fā)生率和長度。3、高強(qiáng)度應(yīng)力刺激(4000μstrain)下調(diào)初級纖毛的發(fā)生率和長度,中低強(qiáng)度的應(yīng)力刺激(1000μstrain和2500μstrain)上調(diào)IFT88蛋白表達(dá)但對纖毛表達(dá)率和長度無明顯影響。應(yīng)力刺激促進(jìn)軟骨細(xì)胞自噬表達(dá),且呈強(qiáng)度依賴性,2500μstrain時達(dá)到峰值,高強(qiáng)度刺激呈抑制效應(yīng)。2500μstrain應(yīng)力刺激在促IFT88、LC3、Beclin1表達(dá)的同時能上調(diào)P-ERK并下調(diào)P-m TOR;水合氯醛破壞纖毛結(jié)構(gòu)后能下調(diào)IFT88、LC3、Beclin1和P-ERK蛋白表達(dá),上調(diào)P-m TOR;同時水合氯醛還能抑制2500μstrain應(yīng)力刺激對IFT88、LC3、Beclin1和P-ERK的促表達(dá)效應(yīng)并上調(diào)P-m TOR表達(dá)。4、應(yīng)力刺激能促進(jìn)軟骨細(xì)胞INPP5E蛋白的表達(dá),在中低強(qiáng)度(1000μstrain和2500μstrain)時最明顯。si RNA下調(diào)INPP5E后,軟骨細(xì)胞內(nèi)初級纖毛和自噬的表達(dá)水平同時降低。與對照組相比,2500μstrain的應(yīng)力刺激能促進(jìn)IFT88、LC3-II、Cyclin D1、COL II的表達(dá),但同時沉默INPP5E后IFT88、LC3-II、Cyclin D1、COL II的表達(dá)均降低�；诹W(xué)刺激的適度運(yùn)動訓(xùn)練有利于骨關(guān)節(jié)炎軟骨的基質(zhì)分泌,同時上調(diào)軟骨組織中IFT88、LC3B和INPP5E的表達(dá)。結(jié)論:1、適當(dāng)強(qiáng)度的應(yīng)力刺激能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和表型維持,而高強(qiáng)度應(yīng)力刺激會影響軟骨細(xì)胞活性。2、初級纖毛和自噬在軟骨發(fā)育過程中存在一定的定位表達(dá)關(guān)聯(lián)性,二者存在交互調(diào)控作用。3、應(yīng)力刺激能影響軟骨細(xì)胞初級纖毛和自噬的表達(dá),應(yīng)力刺激可以通過初級纖毛-ERK-m TOR信號軸轉(zhuǎn)導(dǎo)力學(xué)信號調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬的表達(dá)。4、應(yīng)力刺激能促進(jìn)軟骨INPP5E的表達(dá),其能參與應(yīng)力刺激對初級纖毛和自噬交互作用的表達(dá)調(diào)控,可能是應(yīng)力刺激介導(dǎo)初級纖毛和自噬交互調(diào)控作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。
【圖文】：

干預(yù)后凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，活細(xì)胞的比例有所下降，并且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（如圖3 所示），說明適當(dāng)強(qiáng)度范圍內(nèi)的機(jī)械應(yīng)力刺激并不影響軟骨細(xì)胞的活性，而當(dāng)應(yīng)力強(qiáng)度增加到一定程度之后，凋亡細(xì)胞的比例會增加，應(yīng)力刺激對軟骨增殖能力和細(xì)胞活性的影響均呈現(xiàn)一定的強(qiáng)度依賴性。

不同強(qiáng)度的周期性應(yīng)力刺激對軟骨細(xì)胞活性的影響（紅色代表凋亡細(xì)胞，，綠色代表活細(xì)胞，放大倍數(shù)×100）
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R684.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊開祥;周期性張應(yīng)力對大鼠生長板軟骨細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2014年

本文編號：2707640