【摘要】：目的:1、探索不同強度的機械應力刺激對大鼠軟骨細胞增殖能力、細胞活性和軟骨表型等的影響。2、探究初級纖毛和自噬在軟骨細胞發(fā)育過程中的定位表達和調控關系。3、探究機械應力刺激對初級纖毛和自噬交互作用的影響及ERK-m TOR信號軸在此調控過程中的作用。4、探討多磷酸肌醇5磷酸酶E(INPP5E)在應力介導的初級纖毛和自噬交互調控中的作用。方法:1、體外分離培養(yǎng)新生大鼠的關節(jié)軟骨細胞,通過四點彎曲應力系統(tǒng)對軟骨細胞施加不同強度(1000μstrain、2500μstrain、4000μstrain;1Hz;2h)的周期性應力刺激,通過Western blot實驗檢測增殖相關蛋白Cyclin D1、PCNA和表型相關蛋白COL II表達;RT-PCR檢測表型相關基因COL II和SOX9表達;Live/dead檢測細胞活性變化情況。2、通過透射電鏡、免疫熒光雙標染色等觀察初級纖毛和自噬在軟骨細胞發(fā)育過程中的定位表達情況;分別使用無血清培養(yǎng)基誘導纖毛,水合氯醛破壞纖毛,雷帕霉素(Rapamycin)以及3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)分別激活和抑制自噬,再以免疫熒光雙標染色和Western blot等實驗探究初級纖毛和自噬的表達關聯(lián)性及相關蛋白功能的調控關系。3、通過四點彎曲應力系統(tǒng)給予軟骨細胞不同強度的應力刺激(1000μstrain、2500μstrain、4000μstrain),免疫熒光染色和Western blot等實驗分別檢測軟骨細胞初級纖毛發(fā)生率、長度及功能蛋白IFT88的表達,以及軟骨細胞自噬水平及自噬相關蛋白LC3、Beclin1的表達。用水合氯醛破壞纖毛結構后,再通過Western blot實驗檢測2500μstrain的應力刺激對初級纖毛和自噬相關蛋白交互調控的影響,并檢測ERK-m TOR信號軸相關P-ERK、P-m TOR蛋白的表達情況。4、體外給予軟骨細胞不同強度的應力刺激,Western blot檢測INPP5E蛋白的表達情況;再通過構建并轉染INPP5E的小分子干擾RNA,RT-PCR、Western blot驗證其轉染效率,免疫熒光染色檢測初級纖毛和自噬的表達情況;再在轉染INPP5E si RNA后給予2500μstrain的應力刺激,檢測下調INPP5E后應力刺激對IFT88、LC3、Cyclin D1、COL II蛋白表達的影響,同時動物實驗驗證運動訓練對骨關節(jié)炎軟骨基質分泌和IFT88、LC3B、INPP5E蛋白表達的影響。結果:1、中低強度的應力刺激(1000和2500μstrain)能上調Cyclin D1、PCNA的表達,而高強度應力刺激(4000μstrain)則作用不明顯;中低強度的應力刺激對軟骨細胞的活性沒有明顯影響,而高強度應力刺激后凋亡的軟骨細胞數(shù)量增多。同樣的,中低強度的應力刺激上調表型相關基因COL II、SOX9和COL II蛋白的表達,而高強度刺激則呈抑制效應。2、正常軟骨細胞中存在初級纖毛和自噬的共表達,并且二者在軟骨細胞周期中存在一定的定位表達關系,無血清饑餓可同時誘導初級纖毛、自噬及其蛋白的表達,水合氯醛抑制纖毛的同時下調自噬及其蛋白表達,雷帕霉素在激活自噬的同時上調IFT88蛋白的表達,而3-甲基腺嘌呤抑制自噬的同時減少初級纖毛的發(fā)生率和長度。3、高強度應力刺激(4000μstrain)下調初級纖毛的發(fā)生率和長度,中低強度的應力刺激(1000μstrain和2500μstrain)上調IFT88蛋白表達但對纖毛表達率和長度無明顯影響。應力刺激促進軟骨細胞自噬表達,且呈強度依賴性,2500μstrain時達到峰值,高強度刺激呈抑制效應。2500μstrain應力刺激在促IFT88、LC3、Beclin1表達的同時能上調P-ERK并下調P-m TOR;水合氯醛破壞纖毛結構后能下調IFT88、LC3、Beclin1和P-ERK蛋白表達,上調P-m TOR;同時水合氯醛還能抑制2500μstrain應力刺激對IFT88、LC3、Beclin1和P-ERK的促表達效應并上調P-m TOR表達。4、應力刺激能促進軟骨細胞INPP5E蛋白的表達,在中低強度(1000μstrain和2500μstrain)時最明顯。si RNA下調INPP5E后,軟骨細胞內初級纖毛和自噬的表達水平同時降低。與對照組相比,2500μstrain的應力刺激能促進IFT88、LC3-II、Cyclin D1、COL II的表達,但同時沉默INPP5E后IFT88、LC3-II、Cyclin D1、COL II的表達均降低�；诹W刺激的適度運動訓練有利于骨關節(jié)炎軟骨的基質分泌,同時上調軟骨組織中IFT88、LC3B和INPP5E的表達。結論:1、適當強度的應力刺激能促進軟骨細胞的增殖和表型維持,而高強度應力刺激會影響軟骨細胞活性。2、初級纖毛和自噬在軟骨發(fā)育過程中存在一定的定位表達關聯(lián)性,二者存在交互調控作用。3、應力刺激能影響軟骨細胞初級纖毛和自噬的表達,應力刺激可以通過初級纖毛-ERK-m TOR信號軸轉導力學信號調控軟骨細胞自噬的表達。4、應力刺激能促進軟骨INPP5E的表達,其能參與應力刺激對初級纖毛和自噬交互作用的表達調控,可能是應力刺激介導初級纖毛和自噬交互調控作用的關鍵位點。
【圖文】：

干預后凋亡細胞數(shù)量增多，活細胞的比例有所下降，并且結果具有統(tǒng)計學差異（如圖3 所示），說明適當強度范圍內的機械應力刺激并不影響軟骨細胞的活性，而當應力強度增加到一定程度之后，凋亡細胞的比例會增加，應力刺激對軟骨增殖能力和細胞活性的影響均呈現(xiàn)一定的強度依賴性。

不同強度的周期性應力刺激對軟骨細胞活性的影響（紅色代表凋亡細胞，，綠色代表活細胞，放大倍數(shù)×100）
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R684.3

【參考文獻】

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1 楊開祥;周期性張應力對大鼠生長板軟骨細胞的作用及相關機制[D];華中科技大學;2014年

本文編號：2707640