發(fā)布時(shí)間：2020-06-04 01:28

【摘要】：目的氫氣作為一種理想的抗氧化、抗凋亡物質(zhì),可以選擇性中和自由基中毒性最強(qiáng)的羥自由基(-OH)和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)。而且氫氣具有良好的生物膜通透性,可以快速進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞器。對(duì)諸多離體器官具有保護(hù)作用,如心臟,肺,腎臟等。本研究在組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨方案中加入氫氣,探索氫氣對(duì)關(guān)節(jié)軟骨體外保存效果的影響。再對(duì)骨軟骨移植物保存期間保存液的換液頻率對(duì)保存效果的影響進(jìn)行探索。為進(jìn)一步探求最佳的骨軟骨移植物體外保存方案提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和指導(dǎo)。方法本實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分氫氣對(duì)體外組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨效果的影響利用氫氣發(fā)生裝置制備含有不同氫氣濃度的保存液。以本地健康豬的膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨為研究對(duì)象,無菌條件下用ARTHREX骨軟骨移植器械在豬膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面的內(nèi)外側(cè)負(fù)重區(qū)鉆取圓柱形骨軟骨柱120枚,長(zhǎng)度為10mm,直徑為6mm。隨機(jī)分為4組:Control組(普通保存液);H-1組(氫氣濃度0.2mmol/L);H-2組(氫氣濃度0.4mmol/L);H-3組(氫氣濃度0.8mmol/L)。4℃條件下隔天換液保存。28天后進(jìn)行軟骨細(xì)胞存活率(EB-FDA雙熒光染色)、組織學(xué)(HE染色、番紅O-快綠染色、甲苯胺藍(lán)染色、2型膠原免疫組化染色)、生物力學(xué)以及關(guān)鍵蛋白檢測(cè)(Western Blot),通過分析軟骨細(xì)胞活性、細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖、2型膠原的含量以及特異性蛋白SOD-2、Caspase-3和8-OHdG的表達(dá)水平,對(duì)含氫保存液的保存效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。第二部分換液頻率對(duì)體外組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨效果的影響同樣的方法在豬膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面內(nèi)外側(cè)負(fù)重區(qū)獲取圓柱狀骨軟骨塊60枚,長(zhǎng)10mm,直徑為6mm。將骨軟骨組織隨機(jī)分為3組:A組(保存期間不換液)20枚;B組(保存期間每7天換液)20枚;C組(保存期間每2天換液)20枚。保存28天后分別進(jìn)行軟骨細(xì)胞存活率、組織學(xué)(番紅O染色)和生物力學(xué)性能的檢測(cè)。通過分析和比較各組軟骨細(xì)胞存活率,蛋白多糖含量和楊氏模量指標(biāo)對(duì)保存效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果第一部分,(1)細(xì)胞存活率:在保存28天時(shí),使用EB-FDA雙熒光染色檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示各組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)明顯下降。四組軟骨細(xì)胞存活率比較發(fā)現(xiàn),H-3組細(xì)胞存活率最高,H-3組優(yōu)于H-2組(P0.05);H-3組和H-2組的細(xì)胞存活率明顯優(yōu)于對(duì)照組和H-1組(P0.05);對(duì)照組和H-1組無明顯差異(P0.05)。(2)組織學(xué):HE染色顯示各組軟骨表面光滑,淺層軟骨細(xì)胞體積小,多呈單個(gè)扁平狀;深層軟骨細(xì)胞體積較大,位于軟骨陷窩內(nèi),多成簇狀密集排列。軟骨鈣化層細(xì)胞較少,骨與軟骨連接緊密。番紅O染色和甲苯胺藍(lán)染色顯示H-3組軟骨表面光滑,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,著色最深,蛋白多糖含量最高。二型膠原免疫組化染色顯示H-3組二型膠原含量高于其他各組(P0.05)。(3)生物力學(xué):各組之間楊氏模量沒有明顯差異(P0.05),生物力學(xué)性能沒有區(qū)別。(4)關(guān)鍵蛋白:Western Blot結(jié)果顯示SOD-2表達(dá)水平H-3組優(yōu)于H-2組,H-2組優(yōu)于Control組和H-1組(P0.05),后兩者沒有明顯差異(P0.05)。凋亡因子Caspase-3和DNA損傷后的主要標(biāo)志物8-OHdG表達(dá)H-3組明顯低于Control組、H-1組和H-2組(P0.05)。第二部分,(1)細(xì)胞存活率:在保存28天時(shí),各組細(xì)胞存活率均出現(xiàn)下降。C組軟骨組織細(xì)胞存活率明顯高于A組和B組(P0.05),A組B組細(xì)胞存活率較低,兩組之間無明顯差異(P0.05);(2)組織學(xué):C組軟骨組織番紅O染色著色最深,蛋白多糖含量高于A組和B組(P0.05),A組和B組軟骨組織蛋白多糖含量無明顯差異(P0.05);(3)生物力學(xué):C組軟骨組織楊氏模量高于A組和B組(P0.05),生物力學(xué)性能最好,A組和B組軟骨組織無明顯差異(P0.05)。結(jié)論1、軟骨保存液中加入氫氣通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,能夠提高關(guān)節(jié)軟骨的體外保存效果,且保存效果與氫氣濃度相關(guān)。2、每?jī)商鞊Q液的保存方案保存關(guān)節(jié)軟骨效果要優(yōu)于7天換液和不換液的方案。氫氣的應(yīng)用和換液頻率的選擇為關(guān)節(jié)軟骨體外保存方案的探索提供了新的思路,為軟骨組織庫(kù)的建立提供了新的方案和指導(dǎo)
【圖文】：

圖 1.細(xì)胞存活率檢測(cè)（ 100 倍）A.軟骨組織切片 EB-FDA 雙熒光染色；紅色代表死細(xì)胞，綠色代表活細(xì)胞；B.各組細(xì)胞存活率比較（**P＜0.01）；H-3 組細(xì)胞存活率高于其它組（P＜0.01）；H-2 組細(xì)胞存活率高于 H-1 組和 Control 組（P＜0.01）；H-1 組和 Control 組之間細(xì)胞存活率沒有明顯差異（P＞0.05）。Control 組：DMEM 保存液組；H-1：氫氣濃度 0.2mmol/L 的DMEM 保存液組；H-2：氫氣濃度 0.4mmol/L 的 DMEM 保存液組；H-3：氫氣濃度0.8mmol/L 的 DMEM 保存液組。

圖 1.細(xì)胞存活率檢測(cè)（ 100 倍）A.軟骨組織切片 EB-FDA 雙熒光染色；紅色代表死細(xì)胞，，綠色代表活細(xì)胞；B.各胞存活率比較（**P＜0.01）；H-3 組細(xì)胞存活率高于其它組（P＜0.01）；H-2 組存活率高于 H-1 組和 Control 組（P＜0.01）；H-1 組和 Control 組之間細(xì)胞存活率明顯差異（P＞0.05）。Control 組：DMEM 保存液組；H-1：氫氣濃度 0.2mmol/DMEM 保存液組；H-2：氫氣濃度 0.4mmol/L 的 DMEM 保存液組；H-3：氫氣0.8mmol/L 的 DMEM 保存液組。
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R68

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3 趙U

本文編號(hào)：2695679