【摘要】：目的氫氣作為一種理想的抗氧化、抗凋亡物質(zhì),可以選擇性中和自由基中毒性最強的羥自由基(-OH)和過氧亞硝基陰離子(ONOO-)。而且氫氣具有良好的生物膜通透性,可以快速進入細胞及細胞器。對諸多離體器官具有保護作用,如心臟,肺,腎臟等。本研究在組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨方案中加入氫氣,探索氫氣對關(guān)節(jié)軟骨體外保存效果的影響。再對骨軟骨移植物保存期間保存液的換液頻率對保存效果的影響進行探索。為進一步探求最佳的骨軟骨移植物體外保存方案提供有效的實驗依據(jù)和指導(dǎo)。方法本實驗分為兩部分。第一部分氫氣對體外組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨效果的影響利用氫氣發(fā)生裝置制備含有不同氫氣濃度的保存液。以本地健康豬的膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨為研究對象,無菌條件下用ARTHREX骨軟骨移植器械在豬膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面的內(nèi)外側(cè)負(fù)重區(qū)鉆取圓柱形骨軟骨柱120枚,長度為10mm,直徑為6mm。隨機分為4組:Control組(普通保存液);H-1組(氫氣濃度0.2mmol/L);H-2組(氫氣濃度0.4mmol/L);H-3組(氫氣濃度0.8mmol/L)。4℃條件下隔天換液保存。28天后進行軟骨細胞存活率(EB-FDA雙熒光染色)、組織學(xué)(HE染色、番紅O-快綠染色、甲苯胺藍染色、2型膠原免疫組化染色)、生物力學(xué)以及關(guān)鍵蛋白檢測(Western Blot),通過分析軟骨細胞活性、細胞外基質(zhì)中蛋白多糖、2型膠原的含量以及特異性蛋白SOD-2、Caspase-3和8-OHdG的表達水平,對含氫保存液的保存效果進行評價。第二部分換液頻率對體外組織培養(yǎng)法保存關(guān)節(jié)軟骨效果的影響同樣的方法在豬膝關(guān)節(jié)股骨髁關(guān)節(jié)面內(nèi)外側(cè)負(fù)重區(qū)獲取圓柱狀骨軟骨塊60枚,長10mm,直徑為6mm。將骨軟骨組織隨機分為3組:A組(保存期間不換液)20枚;B組(保存期間每7天換液)20枚;C組(保存期間每2天換液)20枚。保存28天后分別進行軟骨細胞存活率、組織學(xué)(番紅O染色)和生物力學(xué)性能的檢測。通過分析和比較各組軟骨細胞存活率,蛋白多糖含量和楊氏模量指標(biāo)對保存效果進行評價。結(jié)果第一部分,(1)細胞存活率:在保存28天時,使用EB-FDA雙熒光染色檢測各組軟骨細胞存活率。結(jié)果顯示各組細胞存活率均出現(xiàn)明顯下降。四組軟骨細胞存活率比較發(fā)現(xiàn),H-3組細胞存活率最高,H-3組優(yōu)于H-2組(P0.05);H-3組和H-2組的細胞存活率明顯優(yōu)于對照組和H-1組(P0.05);對照組和H-1組無明顯差異(P0.05)。(2)組織學(xué):HE染色顯示各組軟骨表面光滑,淺層軟骨細胞體積小,多呈單個扁平狀;深層軟骨細胞體積較大,位于軟骨陷窩內(nèi),多成簇狀密集排列。軟骨鈣化層細胞較少,骨與軟骨連接緊密。番紅O染色和甲苯胺藍染色顯示H-3組軟骨表面光滑,細胞結(jié)構(gòu)清晰,著色最深,蛋白多糖含量最高。二型膠原免疫組化染色顯示H-3組二型膠原含量高于其他各組(P0.05)。(3)生物力學(xué):各組之間楊氏模量沒有明顯差異(P0.05),生物力學(xué)性能沒有區(qū)別。(4)關(guān)鍵蛋白:Western Blot結(jié)果顯示SOD-2表達水平H-3組優(yōu)于H-2組,H-2組優(yōu)于Control組和H-1組(P0.05),后兩者沒有明顯差異(P0.05)。凋亡因子Caspase-3和DNA損傷后的主要標(biāo)志物8-OHdG表達H-3組明顯低于Control組、H-1組和H-2組(P0.05)。第二部分,(1)細胞存活率:在保存28天時,各組細胞存活率均出現(xiàn)下降。C組軟骨組織細胞存活率明顯高于A組和B組(P0.05),A組B組細胞存活率較低,兩組之間無明顯差異(P0.05);(2)組織學(xué):C組軟骨組織番紅O染色著色最深,蛋白多糖含量高于A組和B組(P0.05),A組和B組軟骨組織蛋白多糖含量無明顯差異(P0.05);(3)生物力學(xué):C組軟骨組織楊氏模量高于A組和B組(P0.05),生物力學(xué)性能最好,A組和B組軟骨組織無明顯差異(P0.05)。結(jié)論1、軟骨保存液中加入氫氣通過抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡,能夠提高關(guān)節(jié)軟骨的體外保存效果,且保存效果與氫氣濃度相關(guān)。2、每兩天換液的保存方案保存關(guān)節(jié)軟骨效果要優(yōu)于7天換液和不換液的方案。氫氣的應(yīng)用和換液頻率的選擇為關(guān)節(jié)軟骨體外保存方案的探索提供了新的思路,為軟骨組織庫的建立提供了新的方案和指導(dǎo)
【圖文】：

圖 1.細胞存活率檢測（ 100 倍）A.軟骨組織切片 EB-FDA 雙熒光染色；紅色代表死細胞，綠色代表活細胞；B.各組細胞存活率比較（**P＜0.01）；H-3 組細胞存活率高于其它組（P＜0.01）；H-2 組細胞存活率高于 H-1 組和 Control 組（P＜0.01）；H-1 組和 Control 組之間細胞存活率沒有明顯差異（P＞0.05）。Control 組：DMEM 保存液組；H-1：氫氣濃度 0.2mmol/L 的DMEM 保存液組；H-2：氫氣濃度 0.4mmol/L 的 DMEM 保存液組；H-3：氫氣濃度0.8mmol/L 的 DMEM 保存液組。

圖 1.細胞存活率檢測（ 100 倍）A.軟骨組織切片 EB-FDA 雙熒光染色；紅色代表死細胞，，綠色代表活細胞；B.各胞存活率比較（**P＜0.01）；H-3 組細胞存活率高于其它組（P＜0.01）；H-2 組存活率高于 H-1 組和 Control 組（P＜0.01）；H-1 組和 Control 組之間細胞存活率明顯差異（P＞0.05）。Control 組：DMEM 保存液組；H-1：氫氣濃度 0.2mmol/DMEM 保存液組；H-2：氫氣濃度 0.4mmol/L 的 DMEM 保存液組；H-3：氫氣0.8mmol/L 的 DMEM 保存液組。
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R68

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本文編號：2695679