【摘要】：研究背景隨著中國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì),我們骨科面臨了許多有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)的問題,如骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)置換后金屬顆粒物對(duì)骨組織的溶解作用、腫瘤骨轉(zhuǎn)移等。有近期研究表明,中國(guó)目前高達(dá)2.1億人其骨量低于正常標(biāo)準(zhǔn),更有甚者,我國(guó)50歲以上人群中骨質(zhì)疏松的發(fā)生率高達(dá)15.7%。骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)骨質(zhì)量下降、骨組織微小結(jié)構(gòu)退化進(jìn)而脆性增加并波及全身,罹患的病癥為胸腰背及全身關(guān)節(jié)酸痛、疼痛甚至骨折,其生活質(zhì)量、生存時(shí)間被極大地降低,并帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。年齡相關(guān)的另一個(gè)常見問題是骨關(guān)節(jié)炎,近20年來,人工關(guān)節(jié)置換數(shù)量呈爆發(fā)式增長(zhǎng)。人工關(guān)節(jié)置換數(shù)量的增長(zhǎng)背后,假體周圍骨溶解的問題也不斷顯現(xiàn),該問題被稱為“顆粒病”。顆粒病是由關(guān)節(jié)假體金屬磨損所產(chǎn)生的碎屑刺激骨組織,經(jīng)一系列病理生理變化后造成骨組織降解,進(jìn)而導(dǎo)致假體松動(dòng)及相應(yīng)的癥狀。腫瘤骨轉(zhuǎn)移是原發(fā)于骨組織外的惡性腫瘤其細(xì)胞經(jīng)血行傳播至骨組織并引起以骨病變及疼痛為主要表現(xiàn)的疾病。隨著腫瘤病人的增加、病程的延長(zhǎng),骨轉(zhuǎn)移也相應(yīng)地增加,而脊柱由于其特性腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率最高。除了肢體疼痛,腫瘤轉(zhuǎn)移到脊柱造成骨損害甚至病理性骨折還可能造成脊髓受壓而致病人癱瘓。骨轉(zhuǎn)移的原發(fā)惡性腫瘤最常見的是乳腺癌,一項(xiàng)研究表明,70%的死于乳腺癌或者前列腺癌的病人發(fā)生了骨轉(zhuǎn)移。這些問題的一個(gè)共同點(diǎn),就是破骨細(xì)胞的激活。破骨細(xì)胞是人體內(nèi)唯一吸收骨質(zhì)的細(xì)胞,它和成骨細(xì)胞維持著骨吸收骨形成平衡以保證骨組織健康。當(dāng)它們被激活、其數(shù)量增加或者功能增強(qiáng)時(shí),即可引起包括骨質(zhì)疏松癥、假體周圍骨溶解、腫瘤骨轉(zhuǎn)移、骨關(guān)節(jié)炎等在內(nèi)的眾多問題。因此,進(jìn)行破骨細(xì)胞相關(guān)疾病的研究具有極高的醫(yī)學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。雖然目前臨床上使用的藥物有許多,如降鈣素、二磷酸鹽、雌激素等在治療這些疾病表現(xiàn)出一定的療效,但仍存在骨折、骨壞死和腫瘤等多種并發(fā)癥的報(bào)道。因此,我們還需要新的效果更好副作用更少的藥物,而這在近年來也成為研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。目前,采用天然植物藥提取物開展抑制破骨細(xì)胞分化和功能發(fā)揮、防治破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨溶解相關(guān)疾病的研究越來越受關(guān)注。我們通過藥物篩選試驗(yàn),一種以往少量用在腫瘤治療研究的中草藥單體竹節(jié)香附素A表現(xiàn)出了有效抑制破骨細(xì)胞的功能。因此,本研究將進(jìn)一步探究竹節(jié)香附素A抑制破骨細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和分子機(jī)制,并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確認(rèn)竹節(jié)香附素A在體內(nèi)預(yù)防和治療破骨細(xì)胞相關(guān)的三類包括乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的主要疾病中的作用,為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。目的研究竹節(jié)香附素A影響破骨細(xì)胞活性的分子生物學(xué)機(jī)制;研究竹節(jié)香附素A對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解模型和裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的作用及細(xì)胞和分子機(jī)制。方法采用6周大C5 7BL/6雌鼠的骨髓腔細(xì)胞作為細(xì)胞源來培養(yǎng)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。破骨細(xì)胞鑒定為TRAP染色、3個(gè)核及以上陽性的細(xì)胞,成骨細(xì)胞分化和功能以ALP染色和茜素紅染色來評(píng)估;竹節(jié)香附素A對(duì)細(xì)胞的毒性以CCK-8試劑盒測(cè)定,并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50;qRCR測(cè)定破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)量;竹節(jié)香附素A對(duì)破骨細(xì)胞骨吸收功能的抑制通過牛骨片吸收試驗(yàn)來驗(yàn)證;western blotting研究竹節(jié)香附素A抑制破骨細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的信號(hào)通路。再通過構(gòu)建小鼠鈦顆粒誘導(dǎo)的顱蓋骨骨溶解模型,根據(jù)組別局部注射竹節(jié)香附素A藥液或者對(duì)照液每天1次,連續(xù)14天。小鼠顱蓋骨標(biāo)本,行microCT掃描分析和組織切片檢查,以研究竹節(jié)香附素A在體內(nèi)對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞骨溶解的抑制;為了進(jìn)一步驗(yàn)證竹節(jié)香附素A在體內(nèi)對(duì)腫瘤骨轉(zhuǎn)移的作用,我們?cè)诼闶竺劰瞧脚_(tái)內(nèi)注射乳腺癌細(xì)胞構(gòu)建乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型。再根據(jù)組別腹腔注射竹節(jié)香附素A藥液或者對(duì)照液每天1次,連續(xù)28天。最后取裸鼠脛骨標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照研究。結(jié)果毒性試驗(yàn)證實(shí)在48小時(shí)內(nèi)低于0.781μM濃度、72小時(shí)內(nèi)低于0.391μM、96小時(shí)內(nèi)低于0.098μM的竹節(jié)香附素A條件下,BMMs細(xì)胞活性沒有收到明顯抑制。IC50在48小時(shí)時(shí)為3.73μM、在72小時(shí)為2.91μM、在96小時(shí)為1.94μM。竹節(jié)香附素A對(duì)其活性的抑制為濃度梯度依賴。我們將BMMs在MSC和RANKL刺激下培養(yǎng),并加入不同濃度的竹節(jié)香附素A(0.2μM、0.4μM、0.8μM)、或者加入0.4μM竹節(jié)香附素A分別培養(yǎng)3、5、7天,結(jié)果與對(duì)照組相比,藥物組破骨細(xì)胞數(shù)和面積均有不同程度下降;同時(shí),竹節(jié)香附素A對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制表現(xiàn)出濃度時(shí)間依賴的特點(diǎn)。RANKL刺激后,空白組破骨細(xì)胞相關(guān)基因出現(xiàn)了明顯的表達(dá)上調(diào),而在竹節(jié)香附素A組,這些基因的表達(dá)有不同程度的下調(diào);同時(shí),竹節(jié)香附素A對(duì)這些基因的表達(dá)表現(xiàn)出濃量和時(shí)間依賴性的抑制作用。我們?cè)诔晒羌?xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入不同濃度的竹節(jié)香附素A,結(jié)果在第7天行ALP染色顯示與空白對(duì)照組相比,成骨細(xì)胞在0.2μ、0.4μM和0.8μM竹節(jié)香附素A均無明顯抑制;在第21天行茜素紅染色顯示0.2μM組成骨細(xì)胞性礦化較空白對(duì)照組增多,其余濃度組無明顯差異。成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)檢測(cè)顯示在第7天空白組和各濃度藥物組無明顯差異,而在第14天藥物組(0.4μM)sparc的表達(dá)明顯增高。這些結(jié)果表明竹節(jié)香附素A在體外對(duì)成骨細(xì)胞分化和功能至少無明顯抑制作用。我們?cè)谂９瞧?無菌)培養(yǎng)BMMs,同時(shí)加入不同濃度的竹節(jié)香附素A,結(jié)果空白組牛骨片上骨吸收面積約為43%,而在0.2μM組,骨吸收的區(qū)域降低到了約18%,在0.4μM組更減少為約7%,在0.8μM組骨吸收不明顯。由此我們可以明確竹節(jié)香附素A在體外具有抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能的作用。在MAPK、NF-κB和SRC/AKT等信號(hào)通路上,AKT在RANKL刺激后10min出現(xiàn)磷酸化,而在竹節(jié)香附素A藥物組中,AKT的磷酸化在10min和30min時(shí)受到明顯抑制;SRC的表達(dá)在RANKL刺激后3天明顯上調(diào),而竹節(jié)香附素A抑制了這種趨勢(shì);JNK、p38、ERK和IκBα的表達(dá)空白對(duì)照組與藥物組無明顯差異。進(jìn)一步地,我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組SRC在破骨細(xì)胞被RANKL刺激3天后明顯升高,加入竹節(jié)香附素A藥物組SRC被明顯抑制,而同時(shí)加入SC79實(shí)驗(yàn)組SRC的抑制趨勢(shì)被挽救。這些結(jié)果表明竹節(jié)香附素A可能通過抑制SRC/AKT信號(hào)通路來抑制破骨細(xì)胞的分化與功能。我們?cè)跇?gòu)建的鈦顆粒誘導(dǎo)的小鼠骨溶解模型上注入生理鹽水(骨溶解對(duì)照組)、不同濃度竹節(jié)香附素A藥液、同時(shí)我們還設(shè)立了空白對(duì)照(不注射鈦顆粒、注射生理鹽水),14天后microCT顯示與空白對(duì)照組相比,對(duì)照組小鼠顱蓋骨溶解非常明顯,而低濃度和高濃度竹節(jié)香附素A藥物組骨溶解有不同程度的緩解。我們還進(jìn)一步在micro-CT三維重建圖像上測(cè)量了骨量與組織量比(BV/TV)和反應(yīng)區(qū)域(ROI)孔隙率,結(jié)果與對(duì)照組相比,低濃度和高濃度RA組的BV/TV均有不同程度的升高,而孔隙率有不同程度的降低。同時(shí)TRAP染色顯示骨溶解對(duì)照組小鼠顱骨溶解區(qū)骨表面有大量多核破骨細(xì)胞聚集,而低濃度和高濃度藥物組的破骨細(xì)胞卻有不同程度的減少。CTSK免疫組化染色也顯示了相同的趨勢(shì)。這些數(shù)據(jù)提示了竹節(jié)香附素A在體內(nèi)能夠抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能,抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系的48小時(shí)和96小時(shí)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,大于6.25μM的竹節(jié)香附素A能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞系生長(zhǎng),IC50分別為18.01μM和15.77μM,相對(duì)于破骨細(xì)胞,MDA-MB-231細(xì)胞系對(duì)竹節(jié)香附素A的耐受性更強(qiáng)。EdU(5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷)檢測(cè)分析表明,經(jīng)不同濃度的竹節(jié)香附素A處理后24小時(shí),MDA-MB-231細(xì)胞系的增殖被明顯抑制。細(xì)胞流式分析顯示竹節(jié)香附素A能顯著增加凋亡細(xì)胞比例。細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示竹節(jié)香附素A對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞系侵襲行為的抑制呈濃度依賴性。我們采用另一種乳腺癌細(xì)胞系BCAP37進(jìn)行研究,也得到了類似結(jié)果。我們將MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞注射入裸鼠脛骨平臺(tái),再每天經(jīng)腹腔注射PBS或竹節(jié)香附素A(100μg/kg),28天后行micro-CT和組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)。結(jié)果與竹節(jié)香附素A藥物組相比,PBS對(duì)照組骨小梁骨丟失明顯增加;竹節(jié)香附素A藥物組BV/TV較對(duì)照組高而骨小梁間隙較對(duì)照組窄;竹節(jié)香附素A藥物組骨皮質(zhì)尚完整而對(duì)照組骨小梁吸收嚴(yán)重且骨皮質(zhì)分離。進(jìn)一步的TUNEL分析顯示與對(duì)照組相比,藥物組乳腺癌細(xì)胞的凋亡程度明顯增加。這些結(jié)果提示竹節(jié)香附素A在體內(nèi)能抑制乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的骨溶解。最后,將MDA-MB-231細(xì)胞在濃度為3μM的竹節(jié)香附素A經(jīng)不同時(shí)間的處理后,我們發(fā)現(xiàn)AKT的磷酸化和mTOR的表達(dá)均不同程度地被下調(diào),提示竹節(jié)香附素A對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的抑制可能通過AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用。結(jié)論竹節(jié)香附素A在體外可以抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收而不抑制成骨細(xì)胞的分化和功能、可以抑制MDA-MB-231和BCAP37乳腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)和侵襲,在體內(nèi)可以抑制鈦顆粒和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系引起的骨溶解,由此我們推測(cè)竹節(jié)香附素A具有治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病和乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在價(jià)值。
【圖文】：

第一部分竹節(jié)香附素Ａ對(duì)破骨細(xì)胞的抑制及對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解的抑制逡逑ＢＭＭｓ細(xì)胞在含ＲＡＮＫＬ和Ｍ－ＣＳＦ的培養(yǎng)基中刺激培養(yǎng)，并加入不同濃度的竹節(jié)逡逑香附素Ａ邋（０，０．４ｍＭ，０．８ｊｉＭ）培養(yǎng)７天，如圖１邋（Ｆ）所示，在對(duì)照組k慰姿勞銎棋義瞎竅赴保擔(dān)埃，

本文編號(hào)：2685893