【摘要】：研究背景隨著中國進入老齡化社會,我們骨科面臨了許多有明顯增長趨勢的問題,如骨質疏松、關節(jié)置換后金屬顆粒物對骨組織的溶解作用、腫瘤骨轉移等。有近期研究表明,中國目前高達2.1億人其骨量低于正常標準,更有甚者,我國50歲以上人群中骨質疏松的發(fā)生率高達15.7%。骨質疏松患者體內骨質量下降、骨組織微小結構退化進而脆性增加并波及全身,罹患的病癥為胸腰背及全身關節(jié)酸痛、疼痛甚至骨折,其生活質量、生存時間被極大地降低,并帶來了巨大的經(jīng)濟和社會負擔。年齡相關的另一個常見問題是骨關節(jié)炎,近20年來,人工關節(jié)置換數(shù)量呈爆發(fā)式增長。人工關節(jié)置換數(shù)量的增長背后,假體周圍骨溶解的問題也不斷顯現(xiàn),該問題被稱為“顆粒病”。顆粒病是由關節(jié)假體金屬磨損所產生的碎屑刺激骨組織,經(jīng)一系列病理生理變化后造成骨組織降解,進而導致假體松動及相應的癥狀。腫瘤骨轉移是原發(fā)于骨組織外的惡性腫瘤其細胞經(jīng)血行傳播至骨組織并引起以骨病變及疼痛為主要表現(xiàn)的疾病。隨著腫瘤病人的增加、病程的延長,骨轉移也相應地增加,而脊柱由于其特性腫瘤轉移的發(fā)生率最高。除了肢體疼痛,腫瘤轉移到脊柱造成骨損害甚至病理性骨折還可能造成脊髓受壓而致病人癱瘓。骨轉移的原發(fā)惡性腫瘤最常見的是乳腺癌,一項研究表明,70%的死于乳腺癌或者前列腺癌的病人發(fā)生了骨轉移。這些問題的一個共同點,就是破骨細胞的激活。破骨細胞是人體內唯一吸收骨質的細胞,它和成骨細胞維持著骨吸收骨形成平衡以保證骨組織健康。當它們被激活、其數(shù)量增加或者功能增強時,即可引起包括骨質疏松癥、假體周圍骨溶解、腫瘤骨轉移、骨關節(jié)炎等在內的眾多問題。因此,進行破骨細胞相關疾病的研究具有極高的醫(yī)學和社會經(jīng)濟價值。雖然目前臨床上使用的藥物有許多,如降鈣素、二磷酸鹽、雌激素等在治療這些疾病表現(xiàn)出一定的療效,但仍存在骨折、骨壞死和腫瘤等多種并發(fā)癥的報道。因此,我們還需要新的效果更好副作用更少的藥物,而這在近年來也成為研究領域的焦點。目前,采用天然植物藥提取物開展抑制破骨細胞分化和功能發(fā)揮、防治破骨細胞介導的骨溶解相關疾病的研究越來越受關注。我們通過藥物篩選試驗,一種以往少量用在腫瘤治療研究的中草藥單體竹節(jié)香附素A表現(xiàn)出了有效抑制破骨細胞的功能。因此,本研究將進一步探究竹節(jié)香附素A抑制破骨細胞的分子生物學機制及乳腺癌骨轉移的細胞和分子機制,并通過動物實驗確認竹節(jié)香附素A在體內預防和治療破骨細胞相關的三類包括乳腺癌骨轉移的主要疾病中的作用,為臨床轉化應用提供理論基礎。目的研究竹節(jié)香附素A影響破骨細胞活性的分子生物學機制;研究竹節(jié)香附素A對鈦顆粒誘導的骨溶解模型和裸鼠乳腺癌骨轉移模型的作用及細胞和分子機制。方法采用6周大C5 7BL/6雌鼠的骨髓腔細胞作為細胞源來培養(yǎng)破骨細胞和成骨細胞。破骨細胞鑒定為TRAP染色、3個核及以上陽性的細胞,成骨細胞分化和功能以ALP染色和茜素紅染色來評估;竹節(jié)香附素A對細胞的毒性以CCK-8試劑盒測定,并計算半數(shù)抑制濃度IC50;qRCR測定破骨細胞、成骨細胞相關基因表達量;竹節(jié)香附素A對破骨細胞骨吸收功能的抑制通過牛骨片吸收試驗來驗證;western blotting研究竹節(jié)香附素A抑制破骨細胞和乳腺癌細胞的信號通路。再通過構建小鼠鈦顆粒誘導的顱蓋骨骨溶解模型,根據(jù)組別局部注射竹節(jié)香附素A藥液或者對照液每天1次,連續(xù)14天。小鼠顱蓋骨標本,行microCT掃描分析和組織切片檢查,以研究竹節(jié)香附素A在體內對鈦顆粒誘導的破骨細胞骨溶解的抑制;為了進一步驗證竹節(jié)香附素A在體內對腫瘤骨轉移的作用,我們在裸鼠脛骨平臺內注射乳腺癌細胞構建乳腺癌骨轉移模型。再根據(jù)組別腹腔注射竹節(jié)香附素A藥液或者對照液每天1次,連續(xù)28天。最后取裸鼠脛骨標本進行對照研究。結果毒性試驗證實在48小時內低于0.781μM濃度、72小時內低于0.391μM、96小時內低于0.098μM的竹節(jié)香附素A條件下,BMMs細胞活性沒有收到明顯抑制。IC50在48小時時為3.73μM、在72小時為2.91μM、在96小時為1.94μM。竹節(jié)香附素A對其活性的抑制為濃度梯度依賴。我們將BMMs在MSC和RANKL刺激下培養(yǎng),并加入不同濃度的竹節(jié)香附素A(0.2μM、0.4μM、0.8μM)、或者加入0.4μM竹節(jié)香附素A分別培養(yǎng)3、5、7天,結果與對照組相比,藥物組破骨細胞數(shù)和面積均有不同程度下降;同時,竹節(jié)香附素A對破骨細胞分化的抑制表現(xiàn)出濃度時間依賴的特點。RANKL刺激后,空白組破骨細胞相關基因出現(xiàn)了明顯的表達上調,而在竹節(jié)香附素A組,這些基因的表達有不同程度的下調;同時,竹節(jié)香附素A對這些基因的表達表現(xiàn)出濃量和時間依賴性的抑制作用。我們在成骨細胞培養(yǎng)體系內加入不同濃度的竹節(jié)香附素A,結果在第7天行ALP染色顯示與空白對照組相比,成骨細胞在0.2μ、0.4μM和0.8μM竹節(jié)香附素A均無明顯抑制;在第21天行茜素紅染色顯示0.2μM組成骨細胞性礦化較空白對照組增多,其余濃度組無明顯差異。成骨細胞特異性基因表達檢測顯示在第7天空白組和各濃度藥物組無明顯差異,而在第14天藥物組(0.4μM)sparc的表達明顯增高。這些結果表明竹節(jié)香附素A在體外對成骨細胞分化和功能至少無明顯抑制作用。我們在牛骨片上(無菌)培養(yǎng)BMMs,同時加入不同濃度的竹節(jié)香附素A,結果空白組牛骨片上骨吸收面積約為43%,而在0.2μM組,骨吸收的區(qū)域降低到了約18%,在0.4μM組更減少為約7%,在0.8μM組骨吸收不明顯。由此我們可以明確竹節(jié)香附素A在體外具有抑制破骨細胞分化和骨吸收功能的作用。在MAPK、NF-κB和SRC/AKT等信號通路上,AKT在RANKL刺激后10min出現(xiàn)磷酸化,而在竹節(jié)香附素A藥物組中,AKT的磷酸化在10min和30min時受到明顯抑制;SRC的表達在RANKL刺激后3天明顯上調,而竹節(jié)香附素A抑制了這種趨勢;JNK、p38、ERK和IκBα的表達空白對照組與藥物組無明顯差異。進一步地,我們發(fā)現(xiàn)對照組SRC在破骨細胞被RANKL刺激3天后明顯升高,加入竹節(jié)香附素A藥物組SRC被明顯抑制,而同時加入SC79實驗組SRC的抑制趨勢被挽救。這些結果表明竹節(jié)香附素A可能通過抑制SRC/AKT信號通路來抑制破骨細胞的分化與功能。我們在構建的鈦顆粒誘導的小鼠骨溶解模型上注入生理鹽水(骨溶解對照組)、不同濃度竹節(jié)香附素A藥液、同時我們還設立了空白對照(不注射鈦顆粒、注射生理鹽水),14天后microCT顯示與空白對照組相比,對照組小鼠顱蓋骨溶解非常明顯,而低濃度和高濃度竹節(jié)香附素A藥物組骨溶解有不同程度的緩解。我們還進一步在micro-CT三維重建圖像上測量了骨量與組織量比(BV/TV)和反應區(qū)域(ROI)孔隙率,結果與對照組相比,低濃度和高濃度RA組的BV/TV均有不同程度的升高,而孔隙率有不同程度的降低。同時TRAP染色顯示骨溶解對照組小鼠顱骨溶解區(qū)骨表面有大量多核破骨細胞聚集,而低濃度和高濃度藥物組的破骨細胞卻有不同程度的減少。CTSK免疫組化染色也顯示了相同的趨勢。這些數(shù)據(jù)提示了竹節(jié)香附素A在體內能夠抑制破骨細胞分化和骨吸收功能,抑制鈦顆粒誘導的骨溶解。MDA-MB-231乳腺癌細胞系的48小時和96小時細胞毒性實驗表明,大于6.25μM的竹節(jié)香附素A能明顯抑制MDA-MB-231細胞系生長,IC50分別為18.01μM和15.77μM,相對于破骨細胞,MDA-MB-231細胞系對竹節(jié)香附素A的耐受性更強。EdU(5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷)檢測分析表明,經(jīng)不同濃度的竹節(jié)香附素A處理后24小時,MDA-MB-231細胞系的增殖被明顯抑制。細胞流式分析顯示竹節(jié)香附素A能顯著增加凋亡細胞比例。細胞體外侵襲實驗顯示竹節(jié)香附素A對MDA-MB-231細胞系侵襲行為的抑制呈濃度依賴性。我們采用另一種乳腺癌細胞系BCAP37進行研究,也得到了類似結果。我們將MDA-MB-231乳腺癌細胞注射入裸鼠脛骨平臺,再每天經(jīng)腹腔注射PBS或竹節(jié)香附素A(100μg/kg),28天后行micro-CT和組織學檢查發(fā)現(xiàn)。結果與竹節(jié)香附素A藥物組相比,PBS對照組骨小梁骨丟失明顯增加;竹節(jié)香附素A藥物組BV/TV較對照組高而骨小梁間隙較對照組窄;竹節(jié)香附素A藥物組骨皮質尚完整而對照組骨小梁吸收嚴重且骨皮質分離。進一步的TUNEL分析顯示與對照組相比,藥物組乳腺癌細胞的凋亡程度明顯增加。這些結果提示竹節(jié)香附素A在體內能抑制乳腺癌細胞誘導的骨溶解。最后,將MDA-MB-231細胞在濃度為3μM的竹節(jié)香附素A經(jīng)不同時間的處理后,我們發(fā)現(xiàn)AKT的磷酸化和mTOR的表達均不同程度地被下調,提示竹節(jié)香附素A對MDA-MB-231細胞生長和侵襲的抑制可能通過AKT/mTOR信號通路發(fā)揮作用。結論竹節(jié)香附素A在體外可以抑制破骨細胞分化和骨吸收而不抑制成骨細胞的分化和功能、可以抑制MDA-MB-231和BCAP37乳腺癌細胞系的生長和侵襲,在體內可以抑制鈦顆粒和MDA-MB-231乳腺癌細胞系引起的骨溶解,由此我們推測竹節(jié)香附素A具有治療破骨細胞相關疾病和乳腺癌骨轉移的潛在價值。
【圖文】：

第一部分竹節(jié)香附素Ａ對破骨細胞的抑制及對鈦顆粒誘導的骨溶解的抑制逡逑ＢＭＭｓ細胞在含ＲＡＮＫＬ和Ｍ－ＣＳＦ的培養(yǎng)基中刺激培養(yǎng)，并加入不同濃度的竹節(jié)逡逑香附素Ａ邋（０，０．４ｍＭ，０．８ｊｉＭ）培養(yǎng)７天，如圖１邋（Ｆ）所示，在對照組k慰姿勞銎棋義瞎竅赴保擔埃，

本文編號：2685893