發(fā)布時間：2020-05-26 13:05

【摘要】：目的:1.探究酸性環(huán)境對人椎間盤髓核細胞凋亡的影響。2.探究人椎間盤髓核細胞中是否存在OGR1亞家族受體,酸性環(huán)境是否能激活人椎間盤髓核細胞中的OGR1亞家族受體。3.探究酸性環(huán)境調(diào)控人椎間盤髓核細胞凋亡的分子機制,為椎間盤退變的預防與治療提供理論依據(jù)。方法:獲取手術(shù)切除的人體椎間盤,仔細分離出其中的髓核組織,對其進行體外細胞培養(yǎng),相差倒置顯微鏡下觀察人椎間盤髓核細胞的形態(tài)。將體外培養(yǎng)的細胞利用瑞氏-吉姆薩、甲苯胺藍、番紅-O和II型膠原免疫細胞化學染色進行觀察和鑒定,并將同步生長的P3代髓核細胞隨機分為三組:對照組用普通培養(yǎng)基(pH值7.4)培養(yǎng),酸性組用酸性培養(yǎng)基(pH值6.8)培養(yǎng)和抑制組用酸性培養(yǎng)基(pH值6.8)+Cucl_2(酸質(zhì)子受體抑制劑)培養(yǎng)。三組髓核細胞用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后,激光共聚焦顯微鏡觀察對照組和酸性組髓核細胞DAPI染色后細胞核的形態(tài)變化。流式細胞儀測定對照組和酸性組髓核細胞的凋亡率。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測三組髓核細胞OGR1亞家族受體(OGR1、G2A、TDAG8及GPR4)基因表達情況。蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測三組髓核細胞OGR1、鈣蛋白酶(Calpain)和鈣調(diào)蛋白磷酸酶(Calcineurin)蛋白表達情況。激光共聚焦顯微鏡觀察酸性刺激對髓核細胞內(nèi)Ca~(2+)水平的影響。酶聯(lián)免疫吸附實驗(Elisa)測定三組髓核細胞培養(yǎng)液中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達情況。結(jié)果:相差倒置顯微鏡下觀察人椎間盤髓核組織消化后獲得的細胞為小球形,細胞核清楚而明亮,胞漿豐富,漂浮在細胞培養(yǎng)基中,有時也可以見到少數(shù)尚未消化完全而抱在一起的細胞團。原代髓核細胞貼壁時間較長,24小時后有少量細胞開始慢慢貼壁,7天后絕大部分細胞完成貼壁,貼壁后的細胞逐漸伸展變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?細胞核呈圓形較大,胞漿豐富,內(nèi)含分泌小體。大約7天左右,細胞間開始有突起互相連接,細胞呈單層生長狀態(tài)。2 3周后,細胞增長逐漸加速,出現(xiàn)非常活躍的增殖及融合,相差倒置顯微鏡下可以見到細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底,增殖活躍處可出現(xiàn)細胞復層。與原代髓核細胞相比,傳代后的髓核細胞貼壁時間明顯縮短,約2 3小時,其增殖及融合速度也明顯加快,大約7天后,培養(yǎng)瓶底鋪滿細胞。體外培養(yǎng)的細胞瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞呈短梭形或多角形,位于中央的細胞核為圓形或橢圓形,染成紅紫色,胞漿豐富,染色較淡。細胞甲苯胺藍、番紅-O和II型膠原免疫細胞化學染色結(jié)果均為陽性,說明培養(yǎng)的細胞可以分泌糖胺聚糖、蛋白多糖和II型膠原,證實實驗中體外培養(yǎng)的細胞為髓核類軟骨細胞。激光共聚焦顯微鏡觀察髓核細胞DAPI染色結(jié)果顯示,鏡下可以看到呈現(xiàn)藍色熒光的細胞核。對照組髓核細胞的細胞核為圓形或橢圓形,形態(tài)完整,染色質(zhì)均勻;而酸性組髓核細胞的細胞核形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)核固縮,核內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)。流式細胞儀測定的對照組和酸性組的髓核細胞凋亡率分別為1.03±0.30和37.14±2.14,兩組間比較具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,人椎間盤髓核細胞表達OGR1、G2A及GPR4mRNA,而TDAG8mRNA未見表達,并且酸性環(huán)境下,OGR1mRNA表達最為明顯(P0.05);抑制組OGR1mRNA表達明顯降低(P0.05),而G2A及GPR4mRNA未見明顯變化(P0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察髓核細胞內(nèi)Ca~(2+)水平結(jié)果顯示,在受到酸性條件刺激后,對照組和抑制組的髓核細胞內(nèi)Ca~(2+)水平均有升高;對照組髓核細胞內(nèi)的Ca~(2+)最高熒光強度為4095,而抑制組髓核細胞內(nèi)的Ca~(2+)最高熒光強度為1536,可見酸性刺激可明顯增加細胞內(nèi)Ca~(2+)水平,加入抑制劑后,細胞內(nèi)Ca~(2+)水平升高受到抑制。Western Blot結(jié)果顯示,酸性環(huán)境下,人椎間盤髓核細胞表達OGR1、Calpain和Calcineurin;加入抑制劑后,OGR1、Calpain和Calcineurin的表達均受到抑制。Elisa結(jié)果顯示,酸性環(huán)境可以抑制髓核細胞Bcl-2蛋白表達,促進Bax及Caspase-3蛋白表達(P0.05);而加入抑制劑后,可以促進髓核細胞Bcl-2蛋白表達,抑制Bax及Caspase-3蛋白表達(P0.05)。結(jié)論:1.酸性環(huán)境可以促進人椎間盤髓核細胞的凋亡。2.人椎間盤髓核細胞中存在OGR1亞家族受體,并且酸性環(huán)境可以激活人椎間盤髓核細胞中的OGR1受體。3.酸性環(huán)境下,人椎間盤髓核細胞中的OGR1受體被激活后,觸發(fā)細胞內(nèi)Ca~(2+)水平升高,激活Ca~(2+)敏感蛋白Calpain和Calcineurin,激活的Ca~(2+)敏感蛋白Calpain和Calcineurin進一步抑制Bcl-2蛋白,激活Bax和Caspase-3蛋白,導致細胞凋亡。
【圖文】：

1.2.2 髓核細胞的染色觀察及鑒定結(jié)果瑞氏-吉姆薩染色顯示 P1 代髓核細胞呈短梭形或多角形，位于中央的細胞核為圓形或橢圓形，被染為紅紫色，，胞漿豐富，染色較淡(圖1.3)；甲苯胺藍染色顯示細胞核被染為藍色，胞漿豐富，染色較淡，說明細胞可以合成糖胺聚糖(圖1.4)；番紅-O染色顯示細胞核被染為紅色，胞漿豐富，染色較淡，說明細胞可以合成蛋白多糖 (圖1.5)；II型膠原免疫細胞化學染色顯示細胞核基本不被染色，胞漿豐富呈棕黃色，說明細胞能合成II型膠原，蘇木素復染后細胞核被染為藍色，胞漿仍保持棕黃色(圖1.6)。圖1.5 番紅-O染色(×200) 圖1.6 II型膠原免疫細胞化學染色(×200 )圖 1.3 瑞氏-吉姆薩藍染色(×200) 圖 1.4 甲苯胺藍染色(×200 )圖 1.1 接種 7 天后的細胞 圖 1.2 接種 21 天后的細胞

染色較淡(圖1.3)；甲苯胺藍染色顯示細胞核被染為藍色，胞漿豐富，染色較淡，說明細胞可以合成糖胺聚糖(圖1.4)；番紅-O染色顯示細胞核被染為紅色，胞漿豐富，染色較淡，說明細胞可以合成蛋白多糖 (圖1.5)；II型膠原免疫細胞化學染色顯示細胞核基本不被染色，胞漿豐富呈棕黃色，說明細胞能合成II型膠原，蘇木素復染后細胞核被染為藍色，胞漿仍保持棕黃色(圖1.6)。圖1.5 番紅-O染色(×200) 圖1.6 II型膠原免疫細胞化學染色(×200 )圖 1.3 瑞氏-吉姆薩藍染色(×200) 圖 1.4 甲苯胺藍染色(×200 )圖 1.1 接種 7 天后的細胞 圖 1.2 接種 21 天后的細胞
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5

【參考文獻】

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1 吳星火;楊操;郜勇;劉瑋;李帥;王琨;張宇坤;宋雨;邵增務(wù);楊述華;;蛋白酶連結(jié)素-1在椎間盤髓核細胞中的表達及作用[J];中華骨科雜志;2017年02期

2 楊強;許海委;馬信龍;徐寶山;;組織工程完整椎間盤的構(gòu)建策略及研究進展[J];中華醫(yī)學雜志;2016年39期

3 韓超;馬信龍;馬劍雄;王濤;;椎間盤pH值改變對其細胞生存代謝影響的研究進展[J];中國脊柱脊髓雜志;2010年04期

本文編號：2681882