【摘要】：目的:探討肥大細(xì)胞(mast cells,MCs)在鏈腺佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的小鼠糖尿病心肌病中的作用及其機(jī)制。方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):在C57BL/6野生型(wide type,WT)小鼠及肥大細(xì)胞缺陷型小鼠(KitW-sh/W-sh)的基礎(chǔ)上,建立由STZ誘導(dǎo)的小鼠糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)模型;同時(shí),自 C57BL/6 野生型小鼠、白介素 6(interleukin 6,IL-6)基因敲除小鼠(IL-6-/-小鼠)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)基因敲除小鼠(TNF-α-/-小鼠)中分離培養(yǎng)骨髓來源的肥大細(xì)胞(bone marrow-derived mast cells,BMMCs),回輸至 Kitw-sh/w-sh 糖尿病心肌病小鼠中,以達(dá)到肥大細(xì)胞重建的目的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為7組,包括(1)C57BL/6野生型小鼠(WT);(2)糖尿病心肌病小鼠(WT + STZ);(3)肥大細(xì)胞缺陷型小鼠(Kitw-sh/W-sh);(4)伴有肥大細(xì)胞缺失的糖尿病心肌病小鼠(Kitw-sh/w-sh+STZ);(5)伴有肥大細(xì)胞缺失的糖尿病心肌病小鼠給予回輸C57BL/6野生型小鼠的肥大細(xì)胞(Kitw-sh/w-sh +STZ + WT-BMMCs);(6)伴有肥大細(xì)胞缺失的糖尿病心肌病小鼠給予回輸IL-6-/-小鼠的肥大細(xì)胞(KitW-sh/w-sh+STZ + IL-6-/--BMMCs);(7)伴有肥大細(xì)胞缺失的糖尿病心肌病小鼠給予回輸TNF-α-/-小鼠的肥大細(xì)胞(Kitw-sh/W-sh + STZ +TNF-α-/--BMMCs)。STZ注射后監(jiān)測血糖并在4周后,進(jìn)行下列檢測:(1)超聲檢測各組小鼠心室重構(gòu)程度及心臟收縮功能,包括舒張期心室間隔厚度(interventricular septum,diastole,IVS;d),舒張期左心室內(nèi)直徑(left ventricular internal diameter,diastole,LVID;d),以及舒張期左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall,diastole,LVPW;d)和縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening,FS%)四項(xiàng)指標(biāo);(2)測量各組小鼠心臟質(zhì)量,利用心臟質(zhì)量指數(shù)(Heart weight index,HWI)反映心臟肥大程度;(3)通過甲苯胺藍(lán)染色檢測存在于各組小鼠心臟組織中的肥大細(xì)胞;(4)苦味酸-天狼星紅(Picric sirius red)染色后,通過偏振光顯微鏡觀察小鼠心臟組織中Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)和Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ)的表達(dá)情況,以反映心臟纖維化程度;(5)RT-PCR檢測各組小鼠心臟組織中TNF-α與IL-6的表達(dá)情況;(6)RT-PCR檢測各組小鼠心臟組織中細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)及賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidase)的表達(dá)情況;(7)TUNEL染色觀察各組小鼠心臟組織中的細(xì)胞凋亡情況。2.體外實(shí)驗(yàn):在分離培養(yǎng)C57BL/6野生型小鼠心肌細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞后,利用來源于WT-BMMCs,IL-6-/--BMMCs及TNF-α-/--BMMCs的裂解液處理以上兩種細(xì)胞,進(jìn)行下列檢測:(1)Western blot檢測心肌成纖維細(xì)胞中 smad 2,p-smad 2,smad 3,p-smad 3,α-SMA,collagen Ⅰ和collagen Ⅲ等心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化;(2)通過對心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察與計(jì)算,得出裂解液處理后心肌細(xì)胞死亡的比率,同時(shí)通過Western blot進(jìn)一步檢測Bax,Bcl-2及Cleaved caspase 3等凋亡相關(guān)指標(biāo)在心肌細(xì)胞中的變化。結(jié)果:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí):(1)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠造模成功后,各組小鼠血糖均明顯升高,體重明顯減低僅出現(xiàn)在WT + STZ組小鼠及回輸WT-BMMCs的Kitw-sh/W-sh+STZ組小鼠;(2)經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn),與WT組相比,WT + STZ小鼠心臟組織中的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增加,提示糖尿病小鼠心臟組織中有肥大細(xì)胞浸潤;(3)肥大細(xì)胞缺失可降低糖尿病心肌病小鼠HWI,改善室間隔與左心室后壁的增厚,減小左心室內(nèi)直徑,提高心臟收縮功能,但這一保護(hù)效應(yīng)在回輸WT-BMMCs的Kitw-sh/w-sh+STZ組小鼠中被削弱;(4)此外,通過苦味酸-天狼星紅染色發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞缺失可抑制糖尿病心肌病小鼠的心肌纖維化,而且RT-PCR結(jié)果提示肥大細(xì)胞可刺激細(xì)胞間黏附分子1及賴氨酰氧化酶的表達(dá)增加,且這一途徑主要與其分泌的TNF-α有關(guān);(5)TUNEL染色證實(shí)肥大細(xì)胞缺失可減少心肌細(xì)胞凋亡。2.體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證肥大細(xì)胞對心肌纖維化與心肌細(xì)胞凋亡的影響:(1)通過利用來源于WT-BMMCs、TNF-α-/--BMMCs、IL-6-/--BMMCs三種細(xì)胞的裂解液處理心肌成纖維細(xì)胞,進(jìn)一步證實(shí)了肥大細(xì)胞可通過激活p-smad2/p-smad 3途徑促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原;(2)同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了肥大細(xì)胞促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡,且這一途徑主要與其分泌的IL-6促進(jìn)Bax及Cleaved caspase 3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)增多有關(guān)。結(jié)論:1.肥大細(xì)胞參與了糖尿病心肌病的形成,在肥大細(xì)胞缺失的情況下可減輕心室重構(gòu),改善心臟功能。2.肥大細(xì)胞缺失后使心肌纖維化減少,心肌細(xì)胞凋亡受到抑制,從而實(shí)現(xiàn)改善糖尿病心肌病的效應(yīng),而在這一過程中,肥大細(xì)胞分泌的IL-6與TNF-α起到了重要作用。3.本實(shí)驗(yàn)通過利用多種基因缺陷動(dòng)物模型,得到較為可靠的結(jié)果,反映了肥大細(xì)胞在糖尿病心肌病中的作用途徑,使我們對肥大細(xì)胞與糖尿病心肌病的關(guān)系有了新的認(rèn)識(shí),也為未來臨床應(yīng)用免疫相關(guān)手段(如肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑)治療糖尿病心肌病提供了重要的基礎(chǔ)理論依據(jù)。
【圖文】：

和試驗(yàn)?zāi)康姆譃槿缦拢辰M：術(shù)后即刻的生物力學(xué)組３頭，術(shù)后１２周的生物力學(xué)組３逡逑頭，術(shù)后１２周的Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ掃描和病理組織切片組３頭。逡逑實(shí)驗(yàn)豬均為單籠圈養(yǎng)，活動(dòng)面積約１．５平方米（圖１－１），手術(shù)前不予限制活動(dòng)，逡逑給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，顆粒飼料喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)豬的圈養(yǎng)和手術(shù)均嚴(yán)格遵守解放軍總醫(yī)院逡逑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)關(guān)于保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各種規(guī)章制度，且本課題組所有成員承諾逡逑在任何時(shí)候均不會(huì)發(fā)生任何違反上述規(guī)章制度的行為。逡逑ｆｍｍ逡逑■Ｈ逡逑圖１－１．實(shí)驗(yàn)豬予以單籠飼養(yǎng)，活動(dòng)面積約１．５平方米。逡逑實(shí)驗(yàn)豬于術(shù)前一周左右采購入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)，一般術(shù)前飼養(yǎng)逡逑一周左右適應(yīng)周圍環(huán)境，觀察實(shí)驗(yàn)豬在大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)過程中無異常反應(yīng)，飲食、逡逑１１逡逑

和試驗(yàn)?zāi)康姆譃槿缦拢辰M：術(shù)后即刻的生物力學(xué)組３頭，術(shù)后１２周的生物力學(xué)組３逡逑頭，術(shù)后１２周的Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ掃描和病理組織切片組３頭。逡逑實(shí)驗(yàn)豬均為單籠圈養(yǎng)，活動(dòng)面積約１．５平方米（圖１－１），手術(shù)前不予限制活動(dòng)，逡逑給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，顆粒飼料喂養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)豬的圈養(yǎng)和手術(shù)均嚴(yán)格遵守解放軍總醫(yī)院逡逑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)關(guān)于保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各種規(guī)章制度，且本課題組所有成員承諾逡逑在任何時(shí)候均不會(huì)發(fā)生任何違反上述規(guī)章制度的行為。逡逑ｆｍｍ逡逑■Ｈ逡逑圖１－１．實(shí)驗(yàn)豬予以單籠飼養(yǎng)，活動(dòng)面積約１．５平方米。逡逑實(shí)驗(yàn)豬于術(shù)前一周左右采購入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)，，一般術(shù)前飼養(yǎng)逡逑一周左右適應(yīng)周圍環(huán)境，觀察實(shí)驗(yàn)豬在大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室圈養(yǎng)過程中無異常反應(yīng)，飲食、逡逑１１逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2;R542.2

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本文編號(hào)：2668102