【摘要】：胰島移植可治療糖尿病、維持患者血糖平衡,但受供體器官短缺及術(shù)后免疫排斥的制約,無法充分展開。研究表明胰島移植術(shù)后排斥反應(yīng)主要以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞排斥為主以及豬是胰島移植供體的理想備選。LEA29Y是一種人工合成的新型免疫抑劑,可阻斷CD28和B7.1/CD80或B7.2/CD86之間的共刺激信號(hào),防止T細(xì)胞的活化,LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬可抑制異種胰島移植面臨的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥。然而,廣泛性表達(dá)LEA29Y會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因豬免疫力低下、不易存活。實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬胰島特異性表達(dá)LEA29Y可以避免這些問題。因此制備PIP(豬胰島素啟動(dòng)子)調(diào)控的轉(zhuǎn)基因豬并篩選培育出遺傳及表達(dá)穩(wěn)定的健康胰島特異性表達(dá)LEA29Y轉(zhuǎn)基因種群,對(duì)進(jìn)一步研究LEA29Y在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的機(jī)制以及為胰島移植提供充足可靠地供體是有意義的。課題組已于2014年成功獲得PIP(豬胰島素啟動(dòng)子)調(diào)控的轉(zhuǎn)基因原代豬,現(xiàn)今已繁育至F2代。本論文以現(xiàn)有的胰島特異性表達(dá)LEA29Y豬種群為研究對(duì)象,應(yīng)用PCR、RT-PCR、Western印跡、免疫組化、免疫熒光等分子手段對(duì)在LEA29Y基因水平的鑒定、目的蛋白的表達(dá)模式等方面做了初步探究,同時(shí)對(duì)種群內(nèi)LEA29Y遺傳及表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析;通過血常規(guī)檢查、石蠟切片及HE染色等方式對(duì)胰島特異性表達(dá)LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬的健康水平進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果顯示:1.本課題組制備的3頭LEA29Y轉(zhuǎn)基因原代豬,DNA水平檢測(cè)均為L(zhǎng)EA29Y陽性。抽檢原代豬81,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均可以實(shí)現(xiàn)胰腺特異表達(dá)LEA29Y。2.通過自然配種的方式可實(shí)現(xiàn)胰腺特異表達(dá)LEA29Y豬種群的擴(kuò)繁。原代豬81基因組內(nèi)同時(shí)整合完整及不完整的的LEA29Y載體片段,并可將不完整載體片段單獨(dú)遺傳給部分后代,不完整載體片段不表達(dá)LEA29Y但不會(huì)對(duì)完整LEA29Y序列的表達(dá)造成影響,單獨(dú)遺傳不完整片段的個(gè)體可通過檢測(cè)LEA29Y序列完整性來排除。除此之外81及其與野生型豬的遺傳了完整目的載體的后代可以實(shí)現(xiàn)胰島特異性表達(dá)LEA29Y,繼代遺傳穩(wěn)定,可為異種胰島移植提供充足的供體。其余2頭原代豬發(fā)現(xiàn)存在非特異表達(dá)LEA29Y的情況,其后代可能會(huì)有益于其它器官的移植。3.胰島特異性表達(dá)LEA29Y對(duì)轉(zhuǎn)基因豬的血液生理指標(biāo)和胸腺、淋巴結(jié)等免疫器官的繁育無明顯影響,轉(zhuǎn)基因豬健康水平良好,有利于為異種胰島移植提供可靠地供體。總之,本研究通過對(duì)本課題組制備的胰島特異性表達(dá)LEA29Y轉(zhuǎn)基因豬的鑒定、繁育、篩選及進(jìn)行健康水平評(píng)估,成功獲得了繼代遺傳穩(wěn)定、健康的胰島特異性表達(dá)LEA29Y豬種群,可為胰島移植提供充足、可靠地供體。
【圖文】：

圖 1 鑒定引物設(shè)計(jì)位置Figure.1 The location of primers on the plasmid表 1 本研究使用的 PCR 引物信息Table1 Information of PCR primers used in the study引物名稱 核苷酸序列（5’-3’） 擴(kuò)增序列大�。↘bp） 退火溫度（℃） 引物用途PIP-F/R F:ACACCCTCTCATAGAGGCCC0.52 64 PCR 檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)；RT-PCR 檢測(cè)DNA 污染R:GGGCCTCGAGGTCATTAGAGLEA-F1/R1 F:ATGGCTTGCCTTGGATTTC1.2 62 PCR 檢測(cè)完整目的基因，RT-PCR 檢測(cè) LEA29Y 是否轉(zhuǎn)錄。R:TCATTTACCCGGAGACAGGL-F/R F:GGAGCCCAAATCTTCTGACAA0.544 58 靈敏度較高，擴(kuò)增 LEA29Y 后半部分R:GGGAGGCGTGGTCTTGTAGTTGAPDH-F/R F:CGTGCCGCCTGGAGAAA0.179k 58 RT-PCR 時(shí)檢測(cè) cDNA 完整性。

結(jié)果轉(zhuǎn)基因豬（編號(hào) 77、81、83）和 1 頭野生型豬耳樣，，提取用 L-F/R 引物檢測(cè)目的基因 LEA29Y；GAPDH-F/R 引NA 提取質(zhì)量，凝膠電泳（圖 2）顯示：4 頭豬均可以檢可；除對(duì)野生型豬外，3 頭原代轉(zhuǎn)基因豬可擴(kuò)出目的大小一致，為陽性個(gè)體。液漂洗三次，每次 5min；于 5% 脫脂奶粉稀釋的一抗溶液（1 TBST 緩沖液洗脫三次，每次 5 min；加入 TBST 稀釋的二抗孵育 1 h；TBST 緩沖液漂洗三次，每次 5 min�；镲@色液 2ml 孵于膜上，Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀顯影
【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R657.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2666774