【摘要】：骨缺損是現(xiàn)今臨床工作面臨的重要問題。僅2011年,美國就有超過100萬例外科手術(shù)涉及到骨缺損的修復(fù)。目前常用的自體骨移植和異體骨移植受限于來源有限,供體損傷,免疫排斥等問題。因此通過構(gòu)建生物工程骨修復(fù)材料對(duì)骨缺損處進(jìn)行修復(fù)成為了骨缺損修復(fù)的重要方向。水凝膠因其良好的生物相容性與安全性成為了生物工程的重要研究領(lǐng)域。智能水凝膠由于可以對(duì)外界產(chǎn)生響應(yīng)性,根據(jù)溫度,pH,壓力等因素產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化成為了微創(chuàng)修復(fù)骨缺損的理想材料。其可以通過注射方法到達(dá)骨缺損區(qū)域并且在調(diào)控下發(fā)生變化而完成對(duì)缺損區(qū)域的填充。人體有著相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境與溫度,因此具有pH敏感性與溫度敏感性的水凝膠在人體內(nèi)運(yùn)用具有先天的優(yōu)勢(shì)。將種子細(xì)胞,誘導(dǎo)因子與智能可注射水凝膠復(fù)合有望構(gòu)成理想的生物工程材料。本課題通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩種智能可注射凝膠作為載成骨分化干細(xì)胞骨修復(fù)材料的作用與效果。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分:1.復(fù)合氧化石墨烯Graphene oxide與PPCN-g獲得溫度敏感性水凝膠GOP。首先通過流變學(xué)實(shí)驗(yàn)證GOP在保留溫度響應(yīng)性的同時(shí)獲得了較高的彈性模量。熒光顯微鏡與掃描電鏡證實(shí)細(xì)胞在GOP中粘附良好并在BMP9誘導(dǎo)下可在凝膠內(nèi)產(chǎn)生豐富的膠原及礦化小節(jié)。Gluc檢測(cè)證實(shí)相比與PPCN-g中,腺病毒感染的iMADs細(xì)胞可更穩(wěn)定的長期存在于GOP并持續(xù)表達(dá)目標(biāo)蛋白。堿性磷酸酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMP9誘導(dǎo)組和對(duì)照組中GOP凝膠內(nèi)iMADs堿性磷酸酶都高于PPCN-g組。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在GOP參與下各階段成骨因子表達(dá)明顯增加,且GOP可以增強(qiáng)BMP9介導(dǎo)的成骨分化。裸鼠皮下異位成瘤模型證實(shí)GOP凝膠的運(yùn)用可增強(qiáng)BMP9誘導(dǎo)下的iMADs細(xì)胞的體內(nèi)成骨作用。同時(shí)免疫組化染色還提示成骨作用的增強(qiáng)除GO本身的成骨誘導(dǎo)能力外可能與其誘導(dǎo)的血管化相關(guān)。2.通過無定形磷酸鈣與羧甲基殼聚糖有機(jī)復(fù)合形成CMC-ACP納米微粒。CMC-ACP凝膠在具有良好的穩(wěn)定性的同時(shí)具備pH響應(yīng)性,可完成自組裝。在人體pH范圍內(nèi),CMC-ACP凝膠具有可注射性和3D打印可行性。將iMADs細(xì)胞載入CMC-ACP凝膠內(nèi)培養(yǎng)后通過SEM與熒光顯微鏡觀察我們發(fā)現(xiàn)iMADs細(xì)胞可以在凝膠內(nèi)及凝膠表面粘附增殖并產(chǎn)生明顯的礦化。Gluc檢測(cè)提示細(xì)胞可以在凝膠內(nèi)生存達(dá)15天并且持續(xù)表達(dá)目的蛋白。此外,CMC-ACP凝膠為細(xì)胞提供了成骨分化的有利環(huán)境:堿性磷酸酶染色與鈣鹽沉積染色均提示CMC-ACP凝膠可有效協(xié)同BMP9介導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CMC-ACP誘導(dǎo)iMADs細(xì)胞成骨分化而抑制了成脂肪分化。這一結(jié)果同樣在裸鼠皮下異位成骨的實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證:雖然CMC-ACP不足以單獨(dú)介導(dǎo)異位成骨的產(chǎn)生,但是可有效協(xié)同BMP9介導(dǎo)的異位成骨:MicroCT顯示BMP9-CMC-ACP組骨塊相比與BMP9-NA組具有高而均勻的骨質(zhì)生成,同時(shí)CMC-ACP組具有良好的血管誘導(dǎo)能力。組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CMC-ACP作為生物支架有效的提高了BMP9介導(dǎo)了成骨能力,在獲得了更多而有序的骨小梁生成和更為豐富的血管長入,抑制了脂肪組織的生成。根據(jù)以上研究我們認(rèn)為,pH與溫度敏感性可注射凝膠復(fù)合BMP9介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨是構(gòu)建具有生物活性的骨修復(fù)材料的有效方法�；谥悄芩z的骨修復(fù)材料時(shí)為骨缺損的修復(fù)提供了一種可行的方向。
【圖文】：

同配比（PPCN-g：GO）GOP 凝膠在溫度變化過程中的粘彈性改The temperature evolution of GOP viscoelastic properties in differ(PPCN-g：GO)彈性檢測(cè)測(cè)試了加入氧化石墨烯是否會(huì)影響 PPCN-g 粘彈性性能。按PPCN-g，置于冰上，檢測(cè)不同配比情況下的流變學(xué)情況發(fā)改變了 PPCN-g 的粘彈性性能。我們發(fā)現(xiàn)單純 PPCN-g 僅 GOP 混合(1:1 )表現(xiàn)出一種凝膠狀結(jié)構(gòu),這提示 GO 的加入某種化學(xué)聯(lián)接而起到了降低液相的作用，但是并沒有改變P 仍然具有良好的可注射性。此外我們發(fā)現(xiàn)通過加入 GO彈性模量：在溫度升高到 40 度的過程中，，PPCN-g 的存儲(chǔ)模GO-P (1:1 PPCN-g：GO)的存儲(chǔ)模量從 8 增加到 309 Pa(圖

24圖 2 GOP/PPCN-g 溫度響應(yīng)性與細(xì)胞裝載能力 2 GOP/PPCN-g temperature response and cell loading capac
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R68;R318.08

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本文編號(hào)：2664397