【摘要】：第一部分骨肉瘤細胞中KDM5C與有絲分裂期紡錘體組裝檢查點關(guān)系的研究目的骨肉瘤是骨科疾病中最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤。目前最常用的骨肉瘤化療藥物多柔比星、異環(huán)磷酰胺、順鉑均為非細胞周期依賴的化療藥物,具有較嚴重的毒副作用。因此針對細胞周期調(diào)控靶點的新型化療藥物是骨肉瘤研究的重要方向之一。紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint,SAC)作為有絲分裂期的關(guān)鍵調(diào)控之一,其活性能夠被著絲粒附近組蛋白H3第4位賴氨酸殘基的甲基化(histone H3 lysine 4 mono-/di-/trimethylation,H3K4me/me2/me3)抑制,從而促進有絲分裂期細胞從中期向后期的轉(zhuǎn)化,加速細胞周期進程、增加遺傳不穩(wěn)定性。賴氨酸去甲基化酶5C(lysine demethylase 5C,KDM5C),能夠特異性催化H3K4me2/me3的去甲基化,調(diào)節(jié)染色體上H3K4me2/me3的水平。KDM5C與多種腫瘤相關(guān),但KDM5C與骨肉瘤的關(guān)系,尤其是其對有絲分裂期紡錘體組裝檢查點的影響尚不清楚。本文擬通過對多種骨肉瘤細胞系的細胞周期同步化,探討KDM5C在骨肉瘤細胞有絲分裂期的變化及其對SAC的調(diào)控。方法利用細胞周期同步化方法,收集不同骨肉瘤細胞系有絲分裂期各時間節(jié)點的細胞樣品,利用Western blot檢測各時間點KDM5C蛋白質(zhì)含量的變化及其翻譯后修飾與有絲分裂期進程的關(guān)系;并用特異性抑制劑CPI-455抑制KDM5C的去甲基化轉(zhuǎn)移酶活性,利用Western blot檢測有絲分裂期進程中抑制KDM5C的去甲基化酶活性對SAC相關(guān)標志蛋白細胞分裂周期蛋白-27(cell division cycle protein 27,cdc27)、周期蛋白B1(Cyclin B1)的影響。結(jié)果1.在骨肉瘤細胞有絲分裂進程中,與SAC相關(guān)的標志蛋白cdc27的磷酸化滯后條帶的位移變化和Cyclin B1的蛋白降解均與文獻報道相似,但KDM5C蛋白含量無明顯變化。2.在宮頸癌細胞HeLa中重復文獻實驗,但在有絲分裂前中期到G1早期中未觀察到KDM5C蛋白水平的明顯變化。3.為觀察KDM5C翻譯后修飾所構(gòu)建的重組截短體質(zhì)粒,在HEK293T中表達出相應(yīng)截短體蛋白質(zhì)。4.骨肉瘤細胞U2OS中檢測KDM5C截短體的翻譯后修飾,并未觀察到明顯的位移減慢或泛素化降解條帶。5.增加KDM5C去甲基化酶含量或抑制其酶活性,相較對照組,SAC相關(guān)標志蛋白cdc27的去磷酸化曲線和Cyclin B1降解曲線未見明顯變化。6.活細胞實時熒光共聚焦成像結(jié)果顯示,相對DMSO對照組,抑制KDM5C酶活性后,SAC相關(guān)的有絲分裂中期向后期進程和染色體分離錯誤比例無明顯差異。結(jié)論在骨肉瘤細胞系有絲分裂期中,KDM5C的蛋白質(zhì)含量不隨有絲分裂期進程而改變,抑制其去甲基化酶活性不影響對SAC的滅活。第二部分抑制KDM5C的去甲基化酶活性對小鼠成肌細胞C2C12增殖、分化的影響目的骨骼肌損傷是運動醫(yī)學中常見的損傷之一,損傷后易導致肌肉組織血腫機化、瘢痕修復,從而降低骨骼肌的收縮能力,并增加再次損傷的可能,對患者的運動能力構(gòu)成了潛在威脅。因此探討影響成肌分化的機制將有助于為此類骨骼肌損傷疾病提供更好的治療方案。H3K4的甲基化與去甲基化能夠通過調(diào)節(jié)靶基因表達,調(diào)控多種重要的生物學活動。賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶2D(Lysine methyltransferase 2D,KTM2D)屬于KTM2甲基化酶家族成員之一,能夠特異性催化H3K4的單甲基化和二甲基化,小鼠中敲除KTM2D將使成肌分化標志蛋白Myogenin(Myo G)、Myosin表達缺陷,進而出現(xiàn)骨骼肌發(fā)育障礙,導致新生小鼠的死亡。目前已知H3K4甲基化水平主要由甲基化酶KTM2家族和去甲基化酶KDM5家族的共同調(diào)節(jié),KDM5C作為去甲基化酶家族KDM5成員之一,具有特異性催化H3K4me3/me2的去甲基化功能,其是否參與調(diào)節(jié)成肌分化過程仍不清楚。本研究擬通過使用KDM5C的特異性抑制劑CPI-455抑制其去甲基轉(zhuǎn)移酶活性,分析KDM5C酶活性抑制后對小鼠成肌細胞C2C12增殖、分化的影響。方法采用特異性抑制劑CPI-455抑制KDM5C酶活性后,利用Western blot和RT-PCR分別檢測成肌細胞分化0h、48h、72h、96h成肌分化標志分子的蛋白質(zhì)和m RNA表達情況。通過CCK-8、Hoechst 33342活細胞核染色計數(shù)檢測KDM5C酶活性抑制對小鼠成肌細胞增殖的影響。結(jié)果1.CPI-455處理組分化48h、72h、96h成肌分化標志分子Myosin和Myo G蛋白表達量均低于同期DMSO處理組,但成肌分化標志分子Actin,Alpha 1(ACTA1)的蛋白表達量則無明顯差異。CPI-455處理組的H3K4me3和KDM5C的蛋白表達量均高于同期DMSO處理組。2.CPI-455處理組分化48h、72h、96h成肌分化標志分子Myosin、Myo G、ACTA1、Myo D、Myf5、Pax7的m RNA相對表達量相較DMSO處理組均無明顯變化。3.CPI-455處理組相較DMSO處理組KDM5C的m RNA相對表達量無明顯變化。4.CCK-8法、Hoechst 33342活細胞核染色計數(shù)法檢測C2C12細胞增殖實驗中CPI-455處理組相較DMSO處理組的相對細胞活性或相對細胞核數(shù)均無明顯差異。結(jié)論抑制KDM5C的去甲基化酶活性可通過下調(diào)成肌分化標志分子Myosin和Myo G的蛋白表達影響C2C12細胞成肌分化,而對C2C12細胞增殖無明顯影響。
【圖文】：

中 KDM5C 的蛋白質(zhì)含量在 G2 期 有絲分裂前中期的變 KDM5C protein level from G2 phase to prometaphase in cellseLa 中 KDM5C 蛋白含量在有絲分裂期的變]報道，在宮頸癌細胞 HeLa 中 KDM5C 蛋白水平呈為驗證文獻報道我們在 HeLa 細胞中重復相關(guān)實驗平的明顯變化（圖 3）。

顯變化（圖 2）。5C 的蛋白質(zhì)含量在 G2 期 有絲分裂前 protein level from G2 phase to prometacells KDM5C 蛋白含量在有絲分裂在宮頸癌細胞 HeLa 中 KDM5C 蛋白文獻報道我們在 HeLa 細胞中重復相顯變化（圖 3）。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R738.1

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本文編號：2662906