【摘要】：目的:肝移植是晚期肝病唯一有效的治療方法。然而,目前在全球范圍內(nèi)供體器官的短缺意味著許多患者會(huì)死于等待不到合適的器官。因此,迫切需要探索晚期肝病的新型治療方案。最近,肝干細(xì)胞與前體細(xì)胞治療作為肝病的一種治療方案為該疾病的治療帶來(lái)了新希望,而成人肝臟中的肝臟前體細(xì)胞(HPCs)由于其可能具有再生肝細(xì)胞的能力而有望成為治療肝臟疾病的重要來(lái)源。已有研究證實(shí)干細(xì)胞的標(biāo)志物性別決定基因9(SOX9)和膽管細(xì)胞標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白7(CK7)可用于鑒定成年小鼠中膽管來(lái)源的HPCs群。然而,如何分離HPCs并進(jìn)行高效率擴(kuò)增仍然是影響其深入研究以及最終進(jìn)入臨床試驗(yàn)的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究,我們希望能建立一種簡(jiǎn)單、高效的肝前體細(xì)胞分離培養(yǎng)方法,能從健康成年小鼠的肝臟中分離出HPCs進(jìn)行體外克隆擴(kuò)增以獲得大量且性狀穩(wěn)定的HPCs,并研究擴(kuò)增所得的HPCs在體內(nèi)外環(huán)境的分化能力。此外,我們將初步探討HPCs移植至小鼠損傷肝臟后的定植、分化情況。研究顯示,TGF-β在肝損傷和肝纖維化過(guò)程發(fā)揮重要作用,最后我們將初步探討TGF-β對(duì)HPCs增殖分化的影響。方法:將6-8周健康小鼠的肝臟灌注去紅細(xì)胞,采用文獻(xiàn)報(bào)道中肺干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法進(jìn)行微小調(diào)整后分離提取小鼠肝組織內(nèi)的前體細(xì)胞,然后從形成克隆的前體細(xì)胞中挑單個(gè)克隆進(jìn)行傳代,擴(kuò)增得到大量的、穩(wěn)定的細(xì)胞群。采用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)擴(kuò)增后的前體細(xì)胞進(jìn)行鑒定,分別用干細(xì)胞標(biāo)記蛋白SOX9、膽管細(xì)胞的標(biāo)記蛋白CK7、成熟肝細(xì)胞的標(biāo)記蛋白(HNF4α)和白蛋白(Alb)來(lái)驗(yàn)證本研究所分離提取的前體細(xì)胞為HPCs(CK7+ SOX9 + HNF4α-Alb-)。采用體外3D培養(yǎng)技術(shù)對(duì)提取的HPCs進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng),在培養(yǎng)第14天后對(duì)其形成的結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記HNF4α和Alb以研究HPCs在3D培養(yǎng)中的分化情況。同時(shí)觀察成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(FGF9)和肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)在3D環(huán)境中對(duì)HPCs分化的影響。采用腎包膜下細(xì)胞注射技術(shù)觀察分離提取的HPCs在體內(nèi)分化情況。在注射后第14天后取材對(duì)HPCs在腎包膜下形成的結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè),同樣通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記HNF4α和Alb以研究在體內(nèi)HPCs的分化情況。同時(shí)觀察成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9(FGF9)和肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF),在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)HPCs分化的影響。通過(guò)腹腔內(nèi)注射CCL4建立小鼠肝損傷模型。然后采用開(kāi)腹經(jīng)脾臟注射的方式進(jìn)行HPCs的肝臟移植,并觀察HPCs在小鼠損傷肝臟中的定植以及定植后的分化情況。為初步探討TGF-β在HPCs增殖和分化中的作用,我們采用TGF-β與其抑制劑SB431542處理HPCs,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組處理后HPCs的細(xì)胞活性,同時(shí)采用定量PCR技術(shù)觀察TGF-β對(duì)HPCs CK7、SOX9、HNF4α和Alb轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果:本研究成功的從健康成年小鼠肝臟組織中分離提取獲得形態(tài)、大小均一、并能穩(wěn)定的傳代和擴(kuò)增的前體細(xì)胞克隆。進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)我們提取的前體細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CK7和SOX9,不表達(dá)HNF4α和Alb,且具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力,提示本研究所提取的前體細(xì)胞為HPCs。此外,該群細(xì)胞可在體外進(jìn)行大量、穩(wěn)定的克隆性擴(kuò)增,并在不分化的狀態(tài)下進(jìn)行大量克隆性擴(kuò)增,即表現(xiàn)出干細(xì)胞的增殖特性。發(fā)現(xiàn)該群HPCs能在3D培養(yǎng)環(huán)境中自發(fā)聚集形成類球樣結(jié)構(gòu),并在球體內(nèi)形成亞結(jié)構(gòu)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該類球樣結(jié)構(gòu)內(nèi)的部分HPCs表達(dá)成熟肝細(xì)胞的標(biāo)記蛋白HNF4α和Alb,提示HPCs在3D培養(yǎng)環(huán)境中可向肝細(xì)胞方向分化。在使用FGF9和HGF處理后,與未處理組相比,表達(dá)HNF4α和Alb的HPCs細(xì)胞數(shù)明顯增多。在腎包膜下誘導(dǎo)HPCs體內(nèi)分化的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)HPCs也可自發(fā)形成囊狀結(jié)構(gòu),也可表達(dá)HNF4α和Alb,形成的結(jié)構(gòu)大小不一,但均比體外3D培養(yǎng)環(huán)境中所獲球體大。此外,在FGF9和HGF處理后,表達(dá)HNF4α和Alb的HPCs細(xì)胞數(shù)明顯增多。采用CCl4腹腔注射成功構(gòu)建小鼠肝損傷模型,并通過(guò)經(jīng)脾臟注射的方式將體外克隆性擴(kuò)增的HPCs移植至小鼠損傷肝臟,并在移植后第7天和第14天都檢測(cè)到HPCs在小鼠損傷肝臟中定植,且部分定植HPCs發(fā)生分化。發(fā)現(xiàn)TGF-β對(duì)提取HPCs的克隆性生長(zhǎng)具有抑制作用,且在TGF-β處理后,HPCs形態(tài)發(fā)生了改變,由類圓形變成梭狀。TGF-β處理后HPCs的相關(guān)標(biāo)志CK7和SOX9轉(zhuǎn)錄水平增高,HNF4α和Alb轉(zhuǎn)錄水平降低,提示TGF-β可影響HPCs的分化。此外,在使用TGF-β抑制劑SB431542后TGF-β對(duì)HPCs的影響消失。結(jié)論:本研究在證實(shí)健康成年小鼠肝臟內(nèi)存在具有干細(xì)胞特性的HPCs后,對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的肺干細(xì)胞分離提取方法進(jìn)行微小調(diào)整后成功從小鼠肝臟中分離出前體細(xì)胞且證實(shí)該群細(xì)胞是膽管來(lái)源的細(xì)胞,在體外具有較強(qiáng)的擴(kuò)增能力,并在體內(nèi)體外均具有向肝細(xì)胞分化的能力。該細(xì)胞群在體內(nèi)體外均具有自發(fā)聚集成球的特點(diǎn),且在體內(nèi)體外形成的類球結(jié)構(gòu)有利于HPCs向成熟肝細(xì)胞分化。此外,本研究證實(shí)體外擴(kuò)增的HPCs可在小鼠損傷肝臟中定植并且具有向肝細(xì)胞分化的能力。最后,本研究證實(shí)了 TGF-β在HPCs增殖和分化中的抑制作用。本研究為HPCs與肝臟再生之間的關(guān)系研究提供了有力的支持,同時(shí)也為肝病的細(xì)胞治療研究提供了新思路。
【圖文】：

逑物逡逑圖１－１成年小鼠肝臟門(mén)靜脈附近存在膽管細(xì)胞標(biāo)志物ＣＫ７邋（紅色）和前體細(xì)胞標(biāo)志逡逑物ＳＯＸ９邋（綠色）共表達(dá)的細(xì)胞（４０0ｘ邋）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｉｌｉａｒｙ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＣＫ７（ｒｅｄ）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ邋ｃｅｌｌ逡逑ｍａｋｅｒＳＯＸ９（ｇｒｅｅｎ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ａｄｕ

Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｉｌｉａｒｙ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＣＫ７（ｒｅｄ）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ邋ｃｅｌｌ逡逑ｍａｋｅｒＳＯＸ９（ｇｒｅｅｎ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ａｄｕｌｔ邋ｍｏｕｓｅ邋ｌｉｖｅｒ邋ｎｅａｒ邋ｐｏｒｔａｌ邋ｖｅｉｎ．邋（４０0ｘ）逡逑■逡逑圖１－２在成年小鼠肝臟中的成熟肝細(xì)胞表達(dá)標(biāo)記蛋白Ａｌｂ邋（紅色）和ＨＮＦ４ａ邋（綠色）（４０0ｘ邋）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｌｂ邋（ｒｅｄ）邋ａｎｄ邋ＨＮＦ４ａ（ｇｒｅｅｎ）邋ｉｎ邋ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ邋ｏｆ邋ａｄｕｌｔ邋ｍｏｕｓｅ邋ｌｉｖｅｒ．逡逑（４００ｘ）逡逑２１逡逑
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R657.3

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本文編號(hào)：2661795