【摘要】：[研究背景]化療誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛(Chemotherapy induced neuropathic pain CINP,簡稱化療痛)是使用化療藥物常見的并發(fā)癥之一,發(fā)生率高達(dá)71%-96%:其臨床的特征主要表現(xiàn)在周圍神經(jīng)損傷或自主神經(jīng)損傷后所產(chǎn)生的一系列的神經(jīng)功能的紊亂癥狀以及體征;其病理特征主要有持續(xù)性的自發(fā)痛或間歇性灼痛、嚴(yán)重的痛覺超敏反應(yīng)以及對正常無害刺激異常疼痛反應(yīng);是神經(jīng)病理性疼痛一種常見類型之一。目前人們對化療痛發(fā)病機制認(rèn)識程度有限,臨床上缺乏針對性治療化療痛的有效手段。因此,探索化療痛發(fā)病機制對優(yōu)化臨床治療策略具有重要的現(xiàn)實意義。背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion DRG)組織是痛覺傳入的初級感覺神經(jīng)元胞體聚集的部位,在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機制中發(fā)揮關(guān)鍵的作用,且與離子通道的關(guān)系密切。背根神經(jīng)節(jié)組織毛細(xì)血管豐富,但是缺乏血腦屏障,因此化療藥物易在背根神經(jīng)節(jié)組織內(nèi)聚集并且會對組織內(nèi)神經(jīng)元產(chǎn)生毒副作用。離子通道是神經(jīng)電活動的分子基礎(chǔ)。以往的研究采用大鼠脊神經(jīng)結(jié)扎(Spinal nerve ligation SNL)誘發(fā)外周神經(jīng)損傷的模型,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后會誘發(fā)感受外界傷害刺激的神經(jīng)元產(chǎn)生異常異位放電活動。此外,相關(guān)研究證實,背根神經(jīng)節(jié)可興奮神經(jīng)元的異常異位放電與神經(jīng)元細(xì)胞膜上的離子通道(包括鈉離子通道、鉀離子通道、鈣離子通道等)的表達(dá)或功能結(jié)構(gòu)的改變有著密切的聯(lián)系。鉀離子通道K 2P 1.1編碼基因為Kcnk1。研究已證實,鉀離子通道的類型之一雙孔鉀離子通道K2P 1.1,在細(xì)胞內(nèi)外鉀離子在濃度梯度驅(qū)動下維持細(xì)胞膜靜息電位。相關(guān)研究利用大鼠腹腔注射化療藥物紫杉醇模型,取出已經(jīng)建立好的的大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)組織,研究結(jié)果提示背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元內(nèi)鉀離子通道K 2p 1.1的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。因此,進一步深入研究背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)鉀離子通道K2p 1.1的基因Kcnk1與化療痛的關(guān)系,或有望揭示化療痛的分子機理。表觀遺傳修飾是指DNA的遺傳序列不發(fā)生改變,但在環(huán)境刺激下遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)會發(fā)生改變,而且這種改變可在發(fā)育過程以及細(xì)胞增殖過程中穩(wěn)定的傳遞。表觀遺傳修飾的機制主要包括DNA的甲基化與去甲基化、組蛋白修飾等。S-腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的甲基供體,在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族(DNA methyltransferases,DNMTs)的催化下,與CpG(胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤)雙核苷酸序列中的胞嘧啶的第5位碳原子的一個甲基基團共價結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的化學(xué)反應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn),DNMTs有3種亞型:DNMT1、DNMT3a、DNMT3b,且3種亞型均有不同的作用機理。DNMT1亞型在保護已經(jīng)穩(wěn)定存在的基因組上的DNA的甲基化上發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,而DNMT3a亞型和DNMT3b亞型在目前比較公認(rèn)的生理功能是與從頭合成的甲基轉(zhuǎn)移酶相一致,其主要在轉(zhuǎn)化DNA的甲基化與去甲基化方面發(fā)揮作用。相關(guān)研究已經(jīng)證實,過度表達(dá)的DNA甲基化通常與基因沉默有著密不可分的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳修飾的常見類型DNA甲基化在腫瘤、血液系統(tǒng)、胚胎發(fā)育過程等相關(guān)疾病發(fā)生與發(fā)展的過程中起著非常重要的作用。TET(ten eleven translocation)甲基胞嘧啶雙加氧酶家族(TETs),包括 TET1、TET2、TET3。TETs具有誘發(fā)DNA的5-甲基胞嘧啶(5-mC)氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)的作用,導(dǎo)致DNA的甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA的去甲基化。TET1和TET3在DNA甲基化與去甲基化轉(zhuǎn)變的過程中起重要的作用,TET2可能參與DNA的甲基化過程。研究表明,TET1是作為一種5-甲基胞嘧啶羥基化酶,可以促進DNA啟動子區(qū)域去甲基化的過程,這不僅與腫瘤、血液系統(tǒng)等疾病的發(fā)病密切相關(guān),而且還可以調(diào)控胚胎干細(xì)胞的發(fā)育過程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),癌癥的發(fā)生與表觀遺傳性改變有關(guān)。以往研究利用SNL模型,背根神經(jīng)節(jié)微注射TET1后過表達(dá)TET1促進背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元DNA去甲基化,脊髓背角神經(jīng)元興奮性降低。我們推測,TET1可能在化療痛發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用,但其表達(dá)調(diào)控的具體機制尚不明確。因此,本課題通過建立化療痛模型,先檢測化療痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)的Kcnk1基因甲基化水平的變化,來驗證化療痛與Kcnk1基因甲基化、去甲基化水平變化的關(guān)系;再通過背根神經(jīng)節(jié)微注射HSV-TET1過表達(dá)TET1,檢測過表達(dá)TET1是否能夠反轉(zhuǎn)這種變化,進而來驗證過表達(dá)的TET1對化療痛背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)Kcnk1基因的甲基化影響。深入研究TET1與表觀遺傳修飾DNA甲基化之間的關(guān)系,有望揭示化療痛的病理生理發(fā)生機制,為臨床治療化療痛提供具有參考價值的新路徑。[研究方法]1.建立化療痛模型選用SD雄性大鼠并分為Vehicle組和紫杉醇(Paclitaxel,Pac)組(每組≥5只);Pac組每隔一天腹腔注射(第0、2、4、6天)化療藥物紫杉醇;Vehicle組腹腔注射對照溶液,注射方法與Pac組相同。2.觀察化療痛模型大鼠的行為學(xué)變化化療痛模型建立后,Vehicle組和Pac組分別在第4、7、10天進行觀察大鼠誘發(fā)痛行為,分別記錄兩組大鼠對機械刺激、熱刺激以及冷刺激的行為學(xué)反應(yīng)變化,并對記錄進行統(tǒng)計分析。3.采用免疫熒光雙標(biāo)定位的實驗方法觀察鉀離子通道K 2p 1.1在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的不同的細(xì)胞之間的表達(dá)共定位建立大鼠化療痛模型,取化療痛模型大鼠L4-5背根神經(jīng)節(jié)組織。本研究對所取的背根神經(jīng)節(jié)組織,采用免疫熒光雙標(biāo)定位方法,檢測K2p 1.1在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞與其他細(xì)胞的表達(dá)分布。4.化療痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1,并分別觀察大鼠行為學(xué)變化對化療痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)微注射HSV-TET1分為兩種方式:第一種(誘導(dǎo)期)是化療痛模型建立第4天背根神經(jīng)節(jié)微注射HSV-TET1,分為Naive組、Pac+HSV+TET1 組、Vehicle+HSV+TET1 組、Pac+PBS 組、Pac+HSV+EGFP 組,分別觀察各組對機械、熱和冷刺激的行為學(xué)變化,并對各組記錄進行統(tǒng)計分析。第二種(維持期)是化療痛大鼠模型建立后第7天在大鼠的背根神經(jīng)節(jié)行顯微注射 HSV-TET1,分為 Naive 組、Pac+HSV+TET1 組、Pac+HSV+EGFP 組,分別觀察其各組對機械、熱和冷刺激的行為學(xué)變化,并對各組記錄進行統(tǒng)計分析。5.化療痛大鼠模型的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)的鉀離子通道K 2p 1.1表達(dá)的變化建立大鼠化療痛模型,取化療痛模型大鼠L4-5背根神經(jīng)節(jié)組織,對組織采用Western blot實驗技術(shù),檢測在不同的時間點L4-5背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)鉀離子通道K2p1.1表達(dá)的變化;取化療痛模型大鼠L4-5背根神經(jīng)節(jié)組織,采用免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù),檢測K2p 1.1表達(dá)改變以及在不同細(xì)胞之間表達(dá)定位;化療痛模型大鼠L4-5背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1,觀察化療痛模型大鼠的L4-5背根神經(jīng)節(jié)過表達(dá)TET1后,觀察TET1的過表達(dá)對化療痛模型大鼠的行為學(xué)反應(yīng)的影響,對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。6.化療痛模型的大鼠背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1后,檢測過表達(dá)TET1對大鼠背根神經(jīng)節(jié)DNA甲基化水平的變化以及對K2P1.1通道蛋白表達(dá)變化的影響構(gòu)建單純皰疹病毒HSV-TET1過表達(dá)載體。在建立化療痛大鼠模型后第4天和第7天,分別給予化療痛大鼠模型L4-5背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1,按照預(yù)期時間,分別取化療痛模型大鼠的L4-5背根神經(jīng)節(jié)組織顯微注射HSV-TET1的背根神經(jīng)節(jié)組織,然后對各組背根神經(jīng)節(jié)組織,采用Western blot技術(shù),檢測在不同的時間點的背根神經(jīng)節(jié)組織神經(jīng)元內(nèi)鉀離子通道基因Kcnk1的表達(dá)變化;取各組背根神經(jīng)節(jié)組織,使用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù),觀察TET1和Kcnk1在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的細(xì)胞共定位,觀察背根神經(jīng)節(jié)過表達(dá)TET1與鉀離子通道K2p1.1的蛋白表達(dá)改變的關(guān)系。7.化療痛模型的大鼠背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1后,驗證過表達(dá)TET1是否通過調(diào)控Kcnk1基因甲基化來參與化療痛建立大鼠化療痛模型背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1后,取過表達(dá)TET1的化療痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織,利用Western blot技術(shù),檢測化療痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)過表達(dá)TET1與Kcnk1基因啟動子之間的關(guān)聯(lián)性;取過表達(dá)TET1的背根神經(jīng)節(jié)組織,利用染色體免疫共沉淀法(Chromatin immunoprecipitation assay ChIP)-PCR的方法,觀察化療痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)鉀離子通道基因Kcnk1啟動子區(qū)的甲基化水平的改變,驗證Kcnk1基因啟動子區(qū)5-mC以及5-hmC的變化。[研究結(jié)果]1.大鼠Vehicle組和Pac組在給化療藥物前所測左右側(cè)后足的基礎(chǔ)閾值(機械刺激縮足反射閾值、熱潛伏縮足閾值和冷刺激縮足反射閾值)均無明顯差異(P0.05)。本課題實驗分別檢測Vehicle組和Pac組大鼠的左右側(cè)后足的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析提示,Pac組的大鼠在建立后的第4、7、10天分別觀察大鼠的行為學(xué)反應(yīng)改變,與Vehicle組進行對比,發(fā)現(xiàn)Pac組的大鼠的機械刺激縮足反射閾值明顯較低(P0.05)、熱潛伏縮足閾值顯著降低(P0.05)、冷刺激縮足反射閾值的次數(shù)明顯增加(P0.05)。2.Pac組的大鼠在給予化療藥物后,取背根神經(jīng)節(jié)組織,行Western blot分子實驗技術(shù),結(jié)果提示,Pac組與Vehicle組相比,Pac組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的鉀離子通道K2p1.1的蛋白和mRNA的表達(dá)均顯著降低。3.背根神經(jīng)節(jié)不同的亞群標(biāo)志物與鉀離子通道K2p1.1行免疫雙標(biāo)染色實驗技術(shù)發(fā)現(xiàn),K2p 1.1陽性細(xì)胞中49.1%為NF200(中、大直徑有髓纖維神經(jīng)元標(biāo)志物)陽性,14.1%為CGRP陽性(中、小直徑多肽能神經(jīng)元),25.4%為IB4陽性(小直徑非多肽能神經(jīng)元)。利用免疫雙標(biāo)染色的實驗技術(shù)檢測K2p1.1在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的細(xì)胞分布發(fā)現(xiàn),K2p 1.1與GS(谷氨酰胺合成酶,衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)幾乎沒有共表達(dá),這些結(jié)果提示,在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)鉀離子通道K2p 1.1的蛋白主要在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。4.化療痛模型的大鼠的背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1,分別觀察大鼠的行為學(xué)變化,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),化療痛模型的大鼠過表達(dá)TET1后,其機械刺激縮足反射閾值、熱潛伏縮足閾值和冷刺激縮足反射閾值均發(fā)現(xiàn)有顯著差異(P0.05)。這些結(jié)果均提示,化療痛模型的大鼠的背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1后過表達(dá)TET1,可阻斷化療藥物誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性疼痛行為學(xué)反應(yīng)。5.化療痛模型的大鼠的背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1后過表達(dá)TET1發(fā)現(xiàn),過表達(dá)TET1可調(diào)控化療痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)DNA甲基化水平降低,而過表達(dá)TET1可誘發(fā)化療痛的大鼠的背根神經(jīng)節(jié)鉀離子通道K2P 1.1蛋白的表達(dá)升高。6.染色體免疫共沉淀-PCR實驗,發(fā)現(xiàn)在化療痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)Kcnk1基因啟動子的R1和R3區(qū),5-mC和5-hmC存在相反的變化,表明化療痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)Kcnk1基因內(nèi)5-mC表達(dá)升高而5-hmC降低,因此,可證實,化療痛大鼠的背根神經(jīng)節(jié)Kcnk1基因的甲基化水平升高;化療痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)顯微注射TET1過表達(dá)TET1,結(jié)果提示,背根神經(jīng)節(jié)過表達(dá)TET1能夠減少Kcnk1基因的甲基化水平。7.化療痛模型大鼠顯微HSV-TET1過表達(dá)TET1后,取大鼠背根神經(jīng)節(jié)行WestionBlot技術(shù),檢測顯示,化療痛并沒有改變TET1的表達(dá),但卻下調(diào)了Kcnk1基因的表達(dá);但是,背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TET1過表達(dá)能夠反轉(zhuǎn)化療痛模型背根神經(jīng)節(jié)K2p1.1蛋白表達(dá)的下降,TET1的過表達(dá)和K2p1.1蛋白表達(dá)反向變化,提示TET1過表達(dá)能夠上調(diào)K2p1.1蛋白表達(dá)。[研究結(jié)論]化療痛模型大鼠的行為學(xué)變化數(shù)據(jù)表明,大鼠的背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1過表達(dá)TET1,能夠緩解腹腔注射化療藥物紫杉醇誘導(dǎo)的化療痛,而且背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)元的鉀離子通道K2p 1.1蛋白的表達(dá)也會相應(yīng)降低,進而引起神經(jīng)元興奮性的增加,可能是參與化療痛發(fā)病的分子機制;鉀離子通道K 2p 1.1蛋白的表達(dá)降低可能是由于背根神經(jīng)節(jié)Kcnk1基因啟動子區(qū)域的甲基化水平的增加。TET1可誘導(dǎo)Kcnk1基因啟動子區(qū)5-mC氧化生成5-hmC,可使Kcnk1基因的去甲基化水平升高,但降低了Kcnk1基因的甲基化水平�；熗床]有改變背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TET1的表達(dá),但下調(diào)了 K2p 1.1蛋白表達(dá)。然而,化療痛模型背根神經(jīng)節(jié)顯微注射HSV-TET1后TET1過表達(dá),可上調(diào)鉀離子通道K 2p 1.1蛋白的表達(dá),并緩解大鼠的化療痛行為。因此,TET1可能是參與化療痛的發(fā)生與發(fā)展的非常重要的因素,本課題研究TET1與化療痛的相互聯(lián)系,或許對全面闡述表觀遺傳修飾的發(fā)生機制有幫助,為揭秘化療痛的分子機理提供有意義的參考,為臨床治療化療痛開辟新的思路。簡而言之,背根神經(jīng)節(jié)TET1過表達(dá)調(diào)控背根神經(jīng)節(jié)DNA甲基化與去甲基化水平變化的機制,可能是預(yù)防和治療化療痛的潛在靶點。
【圖文】：

山東大學(xué)博士學(xué)位論文化療藥后第丨０天，Ｐａｃ組持續(xù)下降（４．２６±邋１．０１邋ｇ），明顯低于Ｖｅｈｉｃｌｅａ），左、右側(cè)后足ＰＷＴ值相比，，兩組ＰＷＴ均無顯著性改變。這些數(shù)據(jù)注射化療藥物紫杉醇可誘導(dǎo)化療痛，且紫杉醇誘導(dǎo)雙側(cè)后足機械痛敏。逡逑機械刺激逡逑

值明顯降低（尸＜０．０５），且Ｐａｃ組降低至（８．５２邋±０．１９邋ｓ）；邋Ｐａｃ組ＰＷＴ值與基礎(chǔ)逡逑值相比明顯降低。給化療藥后第丨０天，Ｐａｃ組持續(xù)下降（８．２４邋士邋０．丨３邋ｓ邋），明顯逡逑低于Ｖｅｈｉｃｌｅ組（圖２ａ），左、右側(cè)后足ＰＷＬ值相比，兩組ＰＷＬ均無顯著性改逡逑變。這些數(shù)據(jù)說明腹腔；Ｈ：射化療藥物紫杉醇可誘導(dǎo)化療痛。Ｒ紫杉醇誘導(dǎo)雙側(cè)后逡逑足熱痛敏。逡逑４１逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614


本文編號：2659249