【摘要】：膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種以關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫脹及功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的慢性退行性疾病,在成年人中發(fā)病率高達(dá)21%,是臨床最常見的慢性疾病之一。由于膝骨關(guān)節(jié)炎的高發(fā)病率、高致殘率和漫長的病程,給患者生活帶來嚴(yán)重影響,也給社會和醫(yī)療帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前臨床主要以藥物治療和手術(shù)治療結(jié)合為主,尚無修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的有效方法。藥物治療主要為非甾體類抗炎藥,可一定程度上緩解疼痛,抑制炎癥反應(yīng),但并不能有效阻止膝關(guān)節(jié)軟骨的退變,而且長期服用此類藥物可能會對人體消化系統(tǒng)及肝、腎功能造成損害。癥狀嚴(yán)重者只能施行手術(shù)置換人工關(guān)節(jié),花費巨大,且具有一定風(fēng)險。因而開發(fā)安全有效、副作用小的能夠減輕疼痛并抑制KOA發(fā)生發(fā)展的藥物和措施迫在眉睫。針灸是中華民族的寶貴財富,已有研究證實電針可以改善KOA患者的疼痛評分。但由于針刺治療的作用機制尚不明確,目前并未廣泛推廣使用。因此尋找針刺治療KOA的新靶點、探索可以替代針刺治療的新方法仍然十分必要。近幾年研究表明年齡、創(chuàng)傷、肥胖、遺傳是骨關(guān)節(jié)炎的主要危險因素,而炎癥反應(yīng)作為上述骨關(guān)節(jié)炎危險因素的共同作用途徑,在其發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用。前期研究證實,在KOA中,炎癥反應(yīng)參與了滑膜損傷、軟骨退化以及痛覺敏化的形成。其中TLR4通路被認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵炎性通路,已有多種小分子化合物被證實可通過阻斷關(guān)節(jié)局部TLR4通路、減輕軟骨損傷,不過由于缺乏特異性、作用效果有限等原因,尚未有臨床研究驗證其效應(yīng)。髓樣分化蛋白2(MD2)是TLR4信號通路激活所必須依賴的輔助因子,錨定于細(xì)胞表面,提供TLR4的結(jié)合位點,易化TLR4的級聯(lián)反應(yīng),由此導(dǎo)致下游NF-κB強烈活化,釋放大量炎癥因子,引發(fā)細(xì)胞因子瀑布式級聯(lián)反應(yīng)。在KOA中,腰段脊髓內(nèi)MD2的表達(dá)及變化如何,以及是否參與了針刺的治療作用,尚未見報道。本研究首先建立了小鼠的KOA實驗動物模型,并在該模型中探索了電針對KOA的治療作用以及脊髓背角內(nèi)MD2的表達(dá)變化。同時,利用MD2基因敲除小鼠、MD2基因過表達(dá)或沉默的慢病毒以及MD2特異性拮抗多肽等方法,探究阻斷MD2對KOA及其痛行為的治療作用,為臨床慢性疼痛防治提供新的靶點。實驗一電針對MIA所致膝骨關(guān)節(jié)炎的治療作用【目的】1.建立小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型并篩選穩(wěn)定模型所需的碘乙酸鹽(MIA)劑量。2.探究電針對MIA所致小鼠KOA的治療作用�！痉椒ā�1.8周齡C57小鼠分為0.3mg MIA組、1.0mg MIA組及生理鹽水對照組,分別于膝關(guān)節(jié)腔注射前,注射后1d,3d,7d和14d測量患肢痛行為(機械縮足反射閾值、雙足承重差異測試)、患側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑及關(guān)節(jié)損傷程度(OOCHAS病理評分)。2.選擇1.0mg MIA作為造模劑量,在造模前及造模后7d、14d,利用上述同樣的方法檢測電針對KOA小鼠患肢痛行為以及關(guān)節(jié)損傷程度的治療作用�！窘Y(jié)果】1.1.0mg MIA造模組痛行為、關(guān)節(jié)損傷及腫脹程度較0.3mg MIA造模組變化更顯著,更穩(wěn)定,且1.0mg組各行為學(xué)與病理結(jié)果之間的發(fā)展階段具有一致性,對照組注射鹽水并未對小鼠膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生明顯影響。2.電針組MIA造模后小鼠患肢痛行為(機械縮足反射閾值、雙足承重差異)均顯著改善,但關(guān)節(jié)腫脹及病理損傷程度并未明顯減輕�！窘Y(jié)論】1.選定1.0mg MIA作為后續(xù)實驗的小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎造模劑量。2.電針可改善MIA所致小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的痛行為。實驗二脊髓背角中MD2參與電針對膝骨關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛作用【目的】1.探究在膝骨關(guān)節(jié)炎疾病過程中小鼠腰段背角處MD2的表達(dá)變化及細(xì)胞定位。2.探究脊髓背角中MD2是否參與了電針對膝骨關(guān)節(jié)炎的鎮(zhèn)痛作用�！痉椒ā�1.利用Western Blot及免疫熒光染色對正常小鼠以及KOA小鼠MIA注射后6h,12h,1d,3d,7d,14d時腰膨大處脊髓背角中MD2表達(dá)水平進(jìn)行檢測,同時利用免疫熒光雙標(biāo)染色對小鼠在KOA后脊髓背角不同類型細(xì)胞(神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)中的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。2.在小鼠KOA模型中,利用Western Blot檢測電針治療下后小鼠第7天脊髓背角中MD2的表達(dá)變化。隨后利用病毒上調(diào)脊髓背角中MD2的表達(dá)后,檢測造模后7d和14d小鼠患肢機械縮足反射閾值與雙足承重差異�！窘Y(jié)果】1.Western Blot及免疫熒光染色結(jié)果顯示KOA小鼠腰膨大處脊髓背角患側(cè)與對側(cè)MD2水平在MIA注射后3d均升高,7d達(dá)到最高峰,14d降低。同時免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示升高的MD2主要表達(dá)在脊髓背角神經(jīng)元中(NeuN~+),而小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1~+)與星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP~+)中,MD2含量較少。2.Western Blot結(jié)果顯示電針治療后,小鼠腰段脊髓背角內(nèi)MD2的表達(dá)在造模后7天顯著降低。同時上調(diào)脊髓背角MD2的表達(dá),可以逆轉(zhuǎn)電針對KOA的鎮(zhèn)痛作用�！窘Y(jié)論】1.脊髓背角內(nèi)MD2在KOA早期表達(dá)明顯增高,7天達(dá)高峰,14的開始降低,且增高的MD2主要表達(dá)在神經(jīng)元中。2.電針可以顯著降低KOA造模后MD2表達(dá)的上調(diào),此外利用病毒上調(diào)脊髓背角中MD2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)電針的鎮(zhèn)痛作用。實驗三敲除或特異性阻斷MD2對膝骨關(guān)節(jié)炎及痛行為的影響【目的】探究全身或脊髓局部MD2敲除或特異性功能阻斷能否減輕KOA小鼠關(guān)節(jié)損傷及疼痛表現(xiàn)�！痉椒ā�1.8周齡MD2~(-/-)、MD2~(+/-)與野生型小鼠各十只,分別對KOA模型前、后的足底機械痛閾、雙足承重差異、患側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑和關(guān)節(jié)病理OOCHAS評分進(jìn)行檢測;2.利用病毒特異性下調(diào)脊髓背角中MD2的表達(dá),觀察MD2下調(diào)組的痛行為及關(guān)節(jié)腫脹程度是否有所改善,并比較單側(cè)下調(diào)組與雙側(cè)下調(diào)組是否有差異;3.合成可特異結(jié)合MD2從而干擾其功能的Tat-CIRP,在KOA造模后前七天通過鎖骨下靜脈給予Tat-CIRP(30mg/kg),觀察上述四項指標(biāo)是否有所改善;4.考慮到全身給藥的非特異性,直接采用鞘內(nèi)給予小劑量(3mg/kg)Tat-CIRP,觀察對KOA痛行為和關(guān)節(jié)損傷的作用�！窘Y(jié)果】1.MD2~(-/-)小鼠在KOA造模后,痛行為學(xué)、患側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹程度及關(guān)節(jié)病理評分發(fā)生明顯改善。2.當(dāng)脊髓背角MD2下調(diào)時,小鼠疼痛表現(xiàn)部分改善,關(guān)節(jié)腫脹程度未見明顯變化,且脊髓背角MD2單側(cè)下調(diào)組與雙側(cè)下調(diào)組在痛行為表現(xiàn)上未見明顯差異。3.KOA小鼠靜脈給予Tat-CIRP阻斷MD2功能后相關(guān)痛行為學(xué)表現(xiàn)及關(guān)節(jié)病理評分有明顯改善。4.鞘內(nèi)給予小劑量Tat-CIRP后,KOA小鼠足底機械痛閾有明顯改善,雙足承重表現(xiàn)有部分改善,但不顯著(P=0.0650),而患側(cè)關(guān)節(jié)直徑、關(guān)節(jié)病理評分并未見明顯影響。同時靜脈給予同樣劑量Tat-CIRP對KOA小鼠相關(guān)痛敏行為學(xué)表現(xiàn)、患側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑及關(guān)節(jié)病理評分均無治療作用�！窘Y(jié)論】當(dāng)敲除MD2或特異性阻斷MD2功能時,可減輕KOA發(fā)生后的痛行為與關(guān)節(jié)損傷,其中脊髓背角中MD2參與了KOA疼痛的形成。說明MD2是膝骨關(guān)節(jié)炎治療的重要新靶點,而我們開發(fā)的MD2靶向肽可能成為治療KOA的新藥。
【圖文】：

圖 1 LPS-MD2-TLR4 信號通路[64]Fig.1 LPS-MD2-TLR4 signaling pathwayR4-MD2 與膝骨關(guān)節(jié)炎TLR4 與幾種疾病均有關(guān)聯(lián)，，且越來越多的證據(jù)表明 TLR4 在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)程中發(fā)揮著重要的作用。研究證明在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中 TLR4 表達(dá)增加[在人類和小鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥和分解反應(yīng)中 TLR4 信號通，并伴隨著 IL-1β、MMP 的表達(dá)增加及一氧化氮釋放、前列腺素 E2 的合成實驗也表明 LPS 刺激加劇了軟骨移植的基質(zhì)退化[67, 68]。另一方面，LPS 引4 通路活化可以誘發(fā)了一種炎癥分解性的滑膜細(xì)胞表型[68]。有研究證實 TLR4 信號通路在機械應(yīng)力、合成代謝因子分泌異常以及軟骨生的炎癥和分解代謝反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[69]。又如激活小鼠成骨細(xì)胞4 信號通路可誘導(dǎo)分解蛋白的表達(dá)從而誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎[70]。骨關(guān)節(jié)炎不僅漸進(jìn)

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文模型的 MIA 造模劑量差異較大（從 0.05mg 到 1.0mg），且沒有一個統(tǒng)一的推薦劑量，那么在我們的研究中哪一個劑量是最為合適的呢？經(jīng)過文獻(xiàn)篩選，我們選取了0.3mg、1.0mg 這兩個常用的 MIA 劑量，通過對疼痛行為、關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)損傷程度的測量選出本實驗的最適造模劑量，實驗設(shè)計如圖 1-1。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R684.3

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本文編號：2649939