【摘要】：研究背景與目的下腰痛(Low Back Pain,LBP)在臨床上較為常見,是門診患者就診的常見病因之一~([1])。下腰痛嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,并且給社會和個人造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失~([2])。目前,如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥及退變性側(cè)凸等,被公認(rèn)的是引起下腰痛主要疾病。通過大量的研究證實(shí),這些疾病均與椎間盤退變(Intervertebral DiscDegeneration,IDD)及其繼發(fā)的病理改變有關(guān)~([3])。下腰痛在我國的發(fā)病率逐年加劇,隨著社會老齡化,腰椎退變性疾病患者亦呈遞增趨勢。目前在臨床上,針對椎間盤疾病,最主要的治療手段仍然是手術(shù)治療~([4])。手術(shù)治療可以有效的緩解臨床癥狀,但是手術(shù)并不能從根本上修復(fù)已經(jīng)退變的椎間盤,并且有可能產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥,給病人帶來更大的痛苦。因此對椎間盤退變機(jī)制及生物治療的深入研究具有十分重要現(xiàn)實(shí)意義。椎間盤的解剖結(jié)構(gòu)分為,中央的髓核、外側(cè)的纖維環(huán)及上下兩端的終板構(gòu)成;椎間盤的主要功能為維持正常的脊柱結(jié)構(gòu),承擔(dān)脊柱的生物應(yīng)力~([5])。髓核組織正常的含水量為椎間盤發(fā)揮生理功能、承擔(dān)應(yīng)力的必要前提,椎間盤退變早期的影像學(xué)表現(xiàn),即為MRI下T2加權(quán)像上髓核組織含水量減少,由高信號逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈托盘柹踔翢o信號~([6])。而含水量的減少,目前認(rèn)為是由于細(xì)胞外基質(zhì)的破環(huán)導(dǎo)致。含水量減少引起椎間高度降低,局部運(yùn)動節(jié)段不穩(wěn),最終導(dǎo)致髓核突出,神經(jīng)根管狹窄等病理變化從而壓迫局部神經(jīng)引起腰痛~([7])。目前不少針對椎間盤退變的臨床研究都是根據(jù)其影像學(xué)上髓核含水量的變化來判斷椎間盤退變進(jìn)程的~([8]),這也是臨床工作中判斷椎間盤退變的重要指標(biāo)之一。研究表明,椎間盤髓核細(xì)胞凋亡增加,炎癥因子的大量侵入,髓核中細(xì)胞外基質(zhì)(Extracelluar matrix,ECM)的代謝紊亂等是導(dǎo)致其發(fā)生退變的主要原因。大量研究結(jié)果證明,而在這些原因之中,髓核細(xì)胞外機(jī)制合成分解代謝紊亂被認(rèn)為是最主要的引起椎間盤退變的機(jī)制~([9])。NP細(xì)胞在ECM代謝中起著關(guān)鍵作用,可分為兩個方面。關(guān)于合成代謝,ECM的主要成分是Ⅱ型膠原(COL-Ⅱ)和蛋白多糖~([10])。蛋白聚糖是必不可少的椎間盤的蛋白多糖的組成部分,與大量的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)側(cè)鏈~([11]);這些分子使椎間盤具有凝膠特性,使其保持水分和機(jī)械支持能力。這些基質(zhì)基因在IDD的表達(dá)下降已被研究者報(bào)告,表明在IDD中合成代謝的減少~([12,13])。在分解代謝方面,以往的研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(ADAMTS)在IDD中上調(diào),這是IDD中ECM降解的主要原因。近年來,再生醫(yī)學(xué)以及生物治療,成為研究熱點(diǎn)~([14])。對于椎間盤退變的生物治療和再生醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究,也聚焦于具有修復(fù)及多向分化潛能的干細(xì)胞身上。該類治療方法通過注射等手段,將具有修復(fù)能力的干細(xì)胞直接作用于退變的椎間盤組織,促進(jìn)椎間盤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)以及基質(zhì)的再生,最終起到改善退變,甚至逆轉(zhuǎn)退變進(jìn)程的治療效果~([15])。目前,針對椎間盤退變的再生治療手段,以間充質(zhì)干細(xì)胞為主。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能、組織替代、調(diào)控微環(huán)境、影響局部免疫及炎癥反應(yīng)等特性,同時間充質(zhì)干細(xì)胞來源多樣,不同來源間多能性存在差異等特性。間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的再生治療的研究非常廣泛,并且取得了很多積極的結(jié)果,然而間充質(zhì)干細(xì)胞治療存在來源獲取難、細(xì)胞易衰老、具有潛在致瘤性等弊端,極大地限制了間充質(zhì)干細(xì)胞的再生醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用。所以,基于干細(xì)胞治療的局限性,更多的研究者將目光投向間充質(zhì)干細(xì)胞所分泌產(chǎn)生的一種物質(zhì)——外泌體上。外泌體是由細(xì)胞分泌的納米級囊泡,囊泡內(nèi)包含編碼RNA,非編碼RNA,蛋白質(zhì),抗原遞呈因子,以及DNA~([16,17])。由于其具有雙層膜結(jié)構(gòu),能夠很容易地穿透細(xì)胞膜達(dá)到將內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)的效果,通過傳遞蛋白質(zhì)和RNA,外泌體可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞和其他器官的功能、活動~([18])。JCI也于2016年做�？瘜ν饷隗w的發(fā)現(xiàn)、作用以及對未來應(yīng)用上的展望做了系統(tǒng)綜述。目前,外泌體的再生效應(yīng),已經(jīng)在其他組織和器官損傷修復(fù)的研究中得到驗(yàn)證,包括心臟損傷治療、肺部損傷治療、肝臟再生治療、骨折愈合、腦卒中后再生治療等~([19,20])。但是間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)椎間盤退變的修復(fù),其效果與干細(xì)胞治療相比優(yōu)勢如何等,目前仍在研究階段,僅有少量報(bào)道。因此本課題針對上述情況,擬對間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在椎間盤髓核細(xì)胞退變過程中的作用進(jìn)行系統(tǒng)研究,力求通過該研究發(fā)現(xiàn)治療椎間盤退變的新的手段,為今后的再生醫(yī)學(xué)相關(guān)治療研究打下基礎(chǔ)。第一部分:間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離與鑒定方法:采集非開放性股骨骨折外傷患者股骨內(nèi)的新鮮骨髓標(biāo)本,按照Percoll密度梯度離心方法,分離和收集有核細(xì)胞,在5%的CO_2和37℃條件下,使用含15%胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基靜止培養(yǎng),細(xì)胞達(dá)90%融合時可以傳代。利用流式細(xì)胞術(shù)、以及誘導(dǎo)分化,鑒定干細(xì)胞特性。細(xì)胞傳代至P2代后,將間充質(zhì)干細(xì)胞接種于T75以上培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增,待細(xì)胞融合度達(dá)到90%時,更換低外泌體血清培養(yǎng)基,每2天換液收集培養(yǎng)基,連續(xù)收集,對收集到的培養(yǎng)基使用超速離心機(jī)多次離心,抽提外泌體。對收集到的外泌體,使用電鏡掃描及Nanosight分析外泌體的性狀,使用Western Blot,檢測外泌體中特定的蛋白表達(dá)情況,使用融合試驗(yàn)明確外泌體的融合能力。結(jié)果:成功培養(yǎng)出狀態(tài)良好的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞7例。流式細(xì)胞試驗(yàn)測得CD29、CD90~+、CD44~+,CD105~-、CD14~-,CD34、CD45不表達(dá)等干細(xì)胞標(biāo)志物,證明所得細(xì)胞符合國際標(biāo)準(zhǔn)。將原代細(xì)胞進(jìn)行成骨及成脂誘導(dǎo),原代細(xì)胞中顯示出明顯的鈣結(jié)節(jié)及脂肪滴,證明其多項(xiàng)分化潛能。細(xì)胞傳代至P2代后,用低外泌體血清培養(yǎng)基大量培養(yǎng)并收集上清,用超速離心法收集抽提外泌體。用Western Blot方法檢測收集到的外泌體中CD81及CD63的表達(dá)情況,同時Nanosight及電鏡檢測外泌體的大小形態(tài)及純度,證明所收集得到的確定為純度較高的外泌體。將所得外泌體用PKH67染料染色并加入到MSC中,結(jié)果顯示外泌體可將MSC染色,證明其膜融合能力。結(jié)論:完成骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng),并通過相關(guān)試驗(yàn)驗(yàn)證,所獲細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞國際標(biāo)準(zhǔn)。傳至P2代后,更換使用低外泌體血清培養(yǎng)基并收集,用超速離心的方法抽提外泌體,并驗(yàn)證其確為外泌體。第二部分:MSC外泌體對退變椎間盤的作用方法:根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì),收集滿足條件的人髓核組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過CCK-8增殖試驗(yàn),驗(yàn)證所得外泌體是否存在細(xì)胞毒性,以及其促進(jìn)髓核細(xì)胞增殖能力。試驗(yàn)分組:設(shè)對照組為超速離心后的上清液作為去外泌體上清作組;設(shè)陰性對照組為HEK293細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)并收集上清進(jìn)行超速離心收集得到的外泌體;設(shè)空白對照組為超速離心后未培養(yǎng)過細(xì)胞的原始培養(yǎng)基;設(shè)實(shí)驗(yàn)組為間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體組。測定各樣本蛋白量,將不同濃度的樣品加入髓核細(xì)胞中,培養(yǎng)24h后,使用Western Blot、PCR以檢測處理后細(xì)胞外基質(zhì)分泌表達(dá)情況。同上述方法處理,驗(yàn)證與髓核細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)MMP、ADAMTS的表達(dá)情況,以及髓核細(xì)胞外基質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。使用高通量測序技術(shù),找尋靶基因,分析外泌體對髓核細(xì)胞體外退變過程的影響。結(jié)果:成功建立體外髓核細(xì)胞系5株。通過增殖試驗(yàn)證明MSC外泌體對NP細(xì)胞不僅沒有細(xì)胞毒性,試驗(yàn)結(jié)果同時還證明MSC外泌體還具備提高髓核細(xì)胞增殖的能力。分組處理后,通過Western Blot、PCR等試驗(yàn)方法驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)組的髓核細(xì)胞較對照組及陰性對照組中,2型膠原、蛋白聚糖表達(dá)量顯著上調(diào),分解代謝相關(guān)MMP1、MMP2、MMP7表達(dá)雖然沒有顯著下調(diào),但是合成相關(guān)的ACAN、COLII、CHSY表達(dá)顯著上調(diào)。高通量轉(zhuǎn)錄組測序,證明MSC外泌體處理后NP細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平基因表達(dá)與對照組相比存在顯著差異。結(jié)論:獲得正常人髓核細(xì)胞系5株。增殖試驗(yàn)證明MSC外泌體對NP細(xì)胞不具備細(xì)胞毒性,同時具有提高NP細(xì)胞增殖的能力。分組定量處理細(xì)胞,并使用Western Blot、PCR方法檢測,發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成,上調(diào)髓核細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成酶以及下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)。第三部分:MSC外泌體上調(diào)HO-1影響椎間盤退變的機(jī)制研究方法:(1)根據(jù)高通量RNA測序結(jié)果篩選候選靶基因。(2)結(jié)合MSC外泌體高通量miRNA測序數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)分析MSC外泌體中miRNA成分對靶基因的影響。(3)篩選與BACH1結(jié)合的、MSC外泌體處理后高表達(dá)的miRNA,并對結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證。(4)研究篩選出的miRNA對BACH1、HO-1表達(dá)的影響。(5)明確MSC外泌體通過microRNA對突變BACH1的結(jié)合位點(diǎn)的影響。結(jié)果:(1)MSC外泌體處理后,NP細(xì)胞低氧相關(guān)基因表達(dá)存在明顯差異。(2)MSC外泌體能夠顯著上HO-1表達(dá),而HO-1抑制性BACH1的表達(dá)則顯著下調(diào)。進(jìn)一步的miRNA測序數(shù)據(jù)顯示MSC來源外泌體中高峰度miRNA均與BACH1存在相互作用,提示其功能可能通過抑制BACH1來發(fā)揮。(3)通過miRNA實(shí)時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)外泌體處理后的髓核細(xì)胞其BACH1抑制性miR-21、-23、-125、-let7均出現(xiàn)明顯上調(diào)。(4)利用miRNA模擬物進(jìn)行miRNA過表達(dá),結(jié)果顯示上述候選miRNA均能不同程度抑制BACH1表達(dá)。(5)MSC外泌體中miR-21、-23、-125、-let7能夠直接抑制BACH1的表達(dá),促進(jìn)HO-1表達(dá),影響椎間盤退變。結(jié)論:證實(shí)MSC外泌體促進(jìn)IDD中ECM合成的作用,是通過miRNA等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子來實(shí)現(xiàn)。證實(shí)對BACH1存在抑制性的miR-21、-23、-125、-let7,在MSC外泌體處理后上調(diào),發(fā)現(xiàn)了外泌體上調(diào)HO-1的作用機(jī)制。小結(jié)本研究首次發(fā)現(xiàn)了外泌體中所含有的BACH1靶向性miRNA因子能夠改善椎間盤退變。我們發(fā)現(xiàn)了miR-21、-23、-125、-let7在外泌體處理后的髓核細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào),而通過功能學(xué)驗(yàn)證明確了上述miRNA確實(shí)能夠引起B(yǎng)ACH1表達(dá)的變化,從而引起HO-1活性的增高,促進(jìn)椎間盤退變的修復(fù)。通過上述研究啟發(fā)了關(guān)于HO-1的調(diào)控機(jī)制。在前期針對HO-1修復(fù)椎間盤退變的基礎(chǔ)進(jìn)一步通過MSC來源外泌體豐富了HO-1的調(diào)控機(jī)制,此外也通過該研究進(jìn)一步證明了MSC來源外泌體促進(jìn)椎間盤修復(fù)的機(jī)制。
【圖文】：

分離、收集有核細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。1天后顯微鏡下可觀察到少量梭形小細(xì)胞貼壁生長。而后繼續(xù)可觀察到典型的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞集落，與國際標(biāo)準(zhǔn)一致。細(xì)胞多次傳代后骨髓MSC出現(xiàn)現(xiàn)衰老傾向。本課題組選用P2代進(jìn)行試驗(yàn)研究，見圖1-1。圖1-1 相差顯微鏡下觀察P2、P4、P6的骨髓MSC細(xì)胞生長情況(200X)。（二）骨髓MSC性質(zhì)鑒定

CD34、CD45 不表達(dá)，符合國際標(biāo)準(zhǔn)，證明確為骨髓 MSC，見圖 1-2。圖1-2 流式細(xì)胞學(xué)檢測MSC表面標(biāo)記物然后驗(yàn)證其多向分化潛能。成骨誘導(dǎo)10天、21天，茜素紅染色，MSC中可見明顯的鮮紅色團(tuán)塊，證明出現(xiàn)鈣質(zhì)沉積，提示細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為具有骨質(zhì)沉積的骨前體細(xì)胞。成脂誘導(dǎo)10天、21天后，油紅O染色30min，MSC中內(nèi)出現(xiàn)染為紅色的脂滴，，證明MSC細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為脂肪前體細(xì)胞。圖1-3 細(xì)胞染色鑒定MSC誘導(dǎo)分化情況，上為成骨誘導(dǎo)后茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色情況（200X），下為成脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂肪滴染色（400X
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5

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2 郝曉燕;我國小麥生產(chǎn)區(qū)位集聚：特征、影響因素及增長效應(yīng)[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

3 陳朝杰;設(shè)計(jì)創(chuàng)新驅(qū)動國家發(fā)展[D];廣東工業(yè)大學(xué);2018年

4 亓立峰;臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及細(xì)胞因子共移植治療腦損傷的分子機(jī)理研究[D];山東大學(xué);2018年

5 馬彩云;間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞修復(fù)肺損傷研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

6 何遠(yuǎn);遺傳性壓力易感性神經(jīng)病家系臨床與基因分析研究[D];武漢大學(xué);2016年

7 朱凌燕;as-microRNA-205-5p修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病足治療中的作用及機(jī)制研究[D];南昌大學(xué);2017年

8 熊q

本文編號：2649496