發(fā)布時(shí)間：2020-04-30 18:43

【摘要】：目的和意義:骨肉瘤是骨科疾病中惡性程度高,致死率也較高的腫瘤之一,目前其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚未明。細(xì)胞外基質(zhì)在組織中可以構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)甚至掌控著細(xì)胞(包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)的命運(yùn)。然而,對(duì)于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,他們對(duì)于ECM性質(zhì)的依賴(lài)程度卻有所不同。本研究旨在通過(guò)研究細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的調(diào)控來(lái)探索骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制,并用成骨細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)一步探索腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境的不同。方法:我們選取骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞作為本文的研究對(duì)象。首先用四種常用的天然支架材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)分別在二維和三維條件下培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。然后用活/死細(xì)胞染色檢測(cè)他們的細(xì)胞活力,用PCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的特征性因子,用ELISA的方法檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的分泌量,用western blot的方法檢測(cè)骨肉瘤特異性蛋白的表達(dá),用免疫熒光染色分別檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的特異性蛋白的表達(dá)。然后將骨肉瘤細(xì)胞分別和四種天然材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)混合后接種于裸鼠的皮下,并觀察他們的成瘤情況,包括腫瘤形成的體積、血管生成的情況和組織學(xué)表現(xiàn)等等。接著通過(guò)以上檢測(cè)分析骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞在四種天然材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)中的行為學(xué),并分析這些行為與四種天然材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)理化性質(zhì)(孔隙大小、力學(xué)強(qiáng)度、粘附性和膨脹率等)差異的關(guān)系。接著我們用甲基丙烯酸酯明膠(GelMA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)制備了9種不同粘附度和強(qiáng)度的PEGDA/GelMA生物支架,并研究其性能�；┧狨ッ髂z由明膠和甲基丙烯酸酐制備而成,通過(guò)核磁共振氫譜的方法來(lái)表征甲基丙烯酸酯明膠,并用購(gòu)買(mǎi)的明膠作對(duì)比,觀察其成分。用掃描電鏡觀察9種不同粘附度和強(qiáng)度的PEGDA/GelMA水凝膠表面結(jié)構(gòu)和孔隙,同時(shí)檢測(cè)其溶脹率、透過(guò)率,粘附性和力學(xué)強(qiáng)度。然后將骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞培養(yǎng)于二維的PEGDA/GelMA水凝膠表面和三維的PEGDA/GelMA水凝膠支架中,并檢測(cè)他們的粘附、增殖和生長(zhǎng)情況。最后分別用Focal adhesion通路抑制劑干預(yù)三維PEGDA/GelMA水凝膠支架中的骨肉瘤細(xì)胞,用Adherens Junction通路抑制劑干預(yù)三維PEGDA/GelMA水凝膠支架中的成骨細(xì)胞,并檢測(cè)他們的相關(guān)功能分子的增長(zhǎng)狀況。結(jié)果:當(dāng)骨肉瘤細(xì)胞二維培養(yǎng)在四種天然支架材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)上時(shí),其活力表現(xiàn)出如下趨勢(shì):膠原基質(zhì)膠海藻酸鈉瓊脂糖。同時(shí),其特征性基因(缺氧誘導(dǎo)因子α(HIFA)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9))的表達(dá),以及特征性蛋白(抗層粘連蛋白(LN)、纖維連接蛋白(FN)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和CD133)的表達(dá)也展現(xiàn)出如上趨勢(shì)。類(lèi)似的,當(dāng)成骨細(xì)胞二維培養(yǎng)在四種天然支架材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)上時(shí),其活力、特征性基因(堿性磷酸酶(ALP)、一型膠原(COL1)、骨形成蛋白(BMP2)和矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2))的mRNA水平,堿性磷酸酶(ALP)的分泌量還有骨鈣素(OCN)的免疫熒光染色都表現(xiàn)出如下趨勢(shì):膠原基質(zhì)膠海藻酸鈉瓊脂糖。但是,當(dāng)骨肉瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)在四種天然支架材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)中時(shí),其活力、特征性基因和蛋白的表達(dá)水平卻與二維培養(yǎng)時(shí)完全不同,其趨勢(shì)為:膠原瓊脂糖基質(zhì)膠海藻酸鈉。與之相反的是,當(dāng)成骨細(xì)胞三維培養(yǎng)在四種天然支架材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)上時(shí),其活力、特征性基因和蛋白的表達(dá)趨勢(shì)仍與其在二維培養(yǎng)中相一致。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與骨肉瘤細(xì)胞在三維培養(yǎng)時(shí)的結(jié)果相一致,生長(zhǎng)在膠原水凝膠中的骨肉瘤細(xì)胞其形成的腫瘤體積最大,新生成的血管最多,侵襲性最強(qiáng),然后依次是瓊脂糖、基質(zhì)膠和海藻酸鈉。四種天然支架材料(膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖)的理化性質(zhì)各有不同,主要體現(xiàn)在粘附性和力學(xué)強(qiáng)度上。粘附性從強(qiáng)到弱為:膠原基質(zhì)膠海藻酸鈉瓊脂糖。力學(xué)強(qiáng)度從大到小為:膠原瓊脂糖基質(zhì)膠海藻酸鈉。我們猜想骨肉瘤細(xì)胞的行為與細(xì)胞外基質(zhì)的力學(xué)強(qiáng)度有關(guān),成骨細(xì)胞則與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性有關(guān)。我們成功應(yīng)用甲基丙烯酸酯明膠(GelMA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)構(gòu)建了9種不同粘附度和強(qiáng)度的PEGDA/GelMA水凝膠,結(jié)果顯示,甲基丙烯酸酯明膠(GelMA)主要調(diào)控的是水凝膠的粘附性,而聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)主要調(diào)控的是水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度。在二維培養(yǎng)時(shí),骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的行為學(xué)表現(xiàn)相一致。對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞,其活力、特征性基因(HIF、VEGF、MMP2和MMP9)的MMP2和MMP9的免疫熒光染色都表明,隨著支架上粘附分子的增加而骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得更好。類(lèi)似的,人成骨細(xì)胞,其活力、特征性基因(ALP、COL1、BMP2和RUNX2)的mRNA水平隨著支架上粘附分子的增加而顯現(xiàn)出更強(qiáng)的表達(dá)趨勢(shì),同時(shí)OCN和ALP的免疫熒光染色也說(shuō)明了成骨細(xì)胞依賴(lài)于粘附分子而生長(zhǎng)。不同的是,在三維(3D)培養(yǎng)條件下,骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)則表現(xiàn)出截然不同的趨勢(shì)。三維培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞不論是增殖還是其特征性基因(HIF、VEGF、MMP2和MMP9)的表達(dá)都隨著支架材料的力學(xué)強(qiáng)度(剛度)的增加而增強(qiáng),而且標(biāo)志著腫瘤惡性程度的乙醛脫氫酶(ALDH)和CD133分子也隨著支架材料的力學(xué)強(qiáng)度(剛度)的增加而表現(xiàn)出增高的趨勢(shì)。與之相反的是,三維培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞并不受支架材料的力學(xué)強(qiáng)度(剛度)的影響。在三維培養(yǎng)條件下,人成骨細(xì)胞不論是增殖還是其特征性基因(ALP、COL1、BMP2和RUNX2)的表達(dá)都隨著支架材料中的粘附分子的增加而增加,且成骨細(xì)胞分泌的骨鈣素(OCN)和鈣鹽都相應(yīng)增加。抑制Focal Adhesion通路后,三維培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)不受材料力學(xué)強(qiáng)度的影響,抑制Adherens Junction通路后,三維培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)不受材料粘附性的影響。結(jié)論:甲基丙烯酸酯明膠(GelMA)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)可以用于構(gòu)建不同粘附度和強(qiáng)度的PEGDA/GelMA水凝膠系統(tǒng)。骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴(lài)于細(xì)胞外基質(zhì)的力學(xué)強(qiáng)度,而這種依賴(lài)性是通過(guò)Focal Adhesion通路介導(dǎo)的。而細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性則是通過(guò)Adherens Junction通路調(diào)控成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。
【圖文】：

圖 1-1 在四種天然材料（膠原、基質(zhì)膠、海藻酸鈉和瓊脂糖）的二維2D）培養(yǎng)條件下骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活力（綠色為活細(xì)胞，紅色死細(xì)胞），標(biāo)尺：300μm。為了進(jìn)一步探究?jī)煞N細(xì)胞在這四種材料的二維培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀們用 pcr 的方法分別檢查兩種細(xì)胞特征性的基因。如圖 1-2 所示，在（2D）培養(yǎng)7天時(shí)，骨肉瘤（MG63）的特征性基因：缺氧誘導(dǎo)因子α（HIFA）管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋 9（MMP9）的表達(dá)量均表現(xiàn)出如下趨勢(shì)：膠原>基質(zhì)膠>海藻酸鈉>瓊

（2D）培養(yǎng)條件下骨肉瘤細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活力（綠色為活細(xì)胞，紅色死細(xì)胞），標(biāo)尺：300μm。為了進(jìn)一步探究?jī)煞N細(xì)胞在這四種材料的二維培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)狀我們用 pcr 的方法分別檢查兩種細(xì)胞特征性的基因。如圖 1-2 所示，在維（2D）培養(yǎng)7天時(shí)，骨肉瘤（MG63）的特征性基因：缺氧誘導(dǎo)因子α（HIFA血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋酶 9（MMP9）的表達(dá)量均表現(xiàn)出如下趨勢(shì)：膠原>基質(zhì)膠>海藻酸鈉>瓊糖，，與細(xì)胞活力相一致。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R738

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃鎮(zhèn);李曉東;黃慶山;林建華;;骨肉瘤不良預(yù)后相關(guān)基因研究進(jìn)展[J];中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志;2019年03期

2 丁萬(wàn)軍;曾濤;戈偉;;骨肉瘤多藥耐藥性相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J];癌癥進(jìn)展;2019年08期

3 吳發(fā)帥;高楓;浦飛飛;邵增務(wù);;長(zhǎng)鏈非編碼RNA在骨肉瘤中的研究進(jìn)展[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年06期

4 鄭穎;王剛陽(yáng);陳瑞玲;蔡鄭東;華瑩奇;;骨肉瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2017年33期

5 黃志鵬;宋科官;;骨肉瘤的診斷及治療進(jìn)展[J];國(guó)際骨科學(xué)雜志;2018年03期

6 丁聚賢;謝興文;許偉;李寧;李晶;蘇積亮;宋學(xué)文;;中醫(yī)藥在骨肉瘤放化療中的作用研究進(jìn)展[J];中醫(yī)正骨;2018年05期

7 徐斌武;李晨;;線粒體融合基因2抑制骨肉瘤及其干細(xì)胞增殖功能分析對(duì)其轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響[J];吉林醫(yī)學(xué);2018年06期

8 張德綢;王廷帆;葛建華;;骨肉瘤最新治療及研究進(jìn)展[J];西南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2018年05期

9 麥威;孔令宇;宋春雨;邢志超;王果元;曲國(guó)蕃;;糖原合成激酶3β對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響[J];實(shí)用腫瘤學(xué)雜志;2016年06期

10 董革輝;劉�；�;韓建華;夏本杰;黃俊瓊;;外泌體致敏樹(shù)突狀細(xì)胞體外抗骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2014年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 李紅;龍勉;;力學(xué)微擾對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[A];第十次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2006年

2 金先慶;羅小輯;;骨肉瘤細(xì)胞骨分化標(biāo)志檢測(cè)及臨床意義[A];中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)第七屆全國(guó)小兒腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

3 趙津;;重組溶瘤腺病毒對(duì)骨肉瘤的抑制作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十七次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2017年

4 傅昭粵;姜東伯;鄭聯(lián)合;楊琨;;BAP31分子的改變對(duì)骨肉瘤腫瘤細(xì)胞行為學(xué)影響的研究[A];第十三屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2018年

5 黃永明;楊仁軒;蘇海濤;張嫻;許少健;徐逸生;;六味地黃湯對(duì)CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增及抗骨肉瘤細(xì)胞的作用分析[A];第十八屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2011年

6 楊迪生;解先寬;葉招明;陶惠民;;反義C-myc重組腺病毒的構(gòu)建及其抗骨肉瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];2004年浙江省骨科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

7 朱波;陳安民;郭風(fēng)勁;許凱;廖暉;;RNA干擾抑制ACP1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)疼痛學(xué)分會(huì)第八屆年會(huì)暨CASP成立二十周年論文集[C];2009年

8 Shuzhong Liu;Yipeng Wang;;MicroRNA-30a downregulation contributes to chemoresistance of osteosarcoma cells through activating Beclin-1-mediated autophagy[A];第九屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第十五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2016年

9 杜利清;樊飛躍;;shRNA抑制Rad51蛋白表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞周期的影響[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

10 杜利清;孟愛(ài)民;王曉春;王月英;吳紅英;張恒;李德冠;路璐;樊飛躍;;shRNA抑制Rad51蛋白表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞周期的影響[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議專(zhuān)刊[C];2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊延良;SARI在人MG-63骨肉瘤細(xì)胞中的功能及機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2019年

2 吳大鵬;XIST/miR-193a-3p/RSF1調(diào)控骨肉瘤中發(fā)生發(fā)展過(guò)程的機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2019年

3 蔣童蒙;細(xì)胞外基質(zhì)粘附性和力學(xué)強(qiáng)度對(duì)骨肉瘤生長(zhǎng)微環(huán)境影響及其機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

4 楊杰翔;miR-21介導(dǎo)的和厚樸酚在骨肉瘤細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

5 李博;二甲雙胍和唑來(lái)膦酸在骨肉瘤中的作用及相關(guān)研究[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

6 喬蘇遲;長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00511在骨肉瘤中的功能及調(diào)控機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

7 牛嘯博;MAPK途徑在脂多糖對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2017年

8 黃金承;雙PI3K/mTOR抑制劑NVP-BEZ235調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

9 劉東寧;甲基化修飾miR-195促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞惡性表型及其分子機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

10 張振琴;低毒性靶向骨肉瘤的鉑配合物設(shè)計(jì)及生物活性研究[D];南京大學(xué);2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 伊力扎提·哈利福;巴戟天水提液對(duì)體外骨肉瘤細(xì)胞中EGFR和HER-2蛋白表達(dá)的影響[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2019年

2 陳昶;凋亡抑制蛋白Livin在骨肉瘤中的表達(dá)及其與Bcl-2相關(guān)性的研究[D];沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院;2019年

3 馬方方;靶向干擾AURKA表達(dá)抑制骨肉瘤U2-OS細(xì)胞生長(zhǎng)的試驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

4 楊棟梁;WWOX基因在骨肉瘤組織的表達(dá)及其臨床意義[D];鄭州大學(xué);2018年

5 王俊義;miR-100對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響[D];河南大學(xué);2018年

6 王勝濤;膜聯(lián)蛋白A3在骨肉瘤細(xì)胞系HOS中的表達(dá)及意義[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2018年

7 蔡啟軒;骨肉瘤非編碼RNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與相關(guān)功能分析[D];吉林大學(xué);2018年

8 羅勇健;miR-422a對(duì)順鉑抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖的影響[D];南華大學(xué);2018年

9 陳亞軍;miRNA-422a在紫杉醇抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖中的作用[D];南華大學(xué);2018年

10 李毅;miR-124對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞株增殖和侵襲的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2646067