發(fā)布時(shí)間：2020-04-30 16:42

【摘要】：目的:探討慢性不可預(yù)知性應(yīng)激對(duì)椎間盤退變的影響以及積極應(yīng)對(duì)慢性應(yīng)激狀態(tài)對(duì)椎間盤再生的作用機(jī)制。方法:第一部分:64只Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組,即正常對(duì)照組(NC group)和慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型組(CUS group),每組32只。采用10種不同的刺激作為應(yīng)激原,不可預(yù)知性刺激21天建立CUS模型,評(píng)價(jià)大鼠行為改變特。用27G穿刺針以經(jīng)皮椎間盤中心穿刺法對(duì)兩組大鼠Co7-8椎間盤進(jìn)行穿刺,次日起對(duì)CUS模型組繼續(xù)進(jìn)行刺激。穿刺后分別在0、2、4、8周時(shí)(每時(shí)間點(diǎn)8只/組),采用MRI檢查,改良Pfirrmann分級(jí)評(píng)分;組織切片HE染色,Han等的椎間盤退變組織學(xué)評(píng)分的方法對(duì)兩組大鼠穿刺椎間盤的退變程度進(jìn)行比較,初步探討慢性應(yīng)激對(duì)椎間盤退變的作用;第二部分:32只Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組,即NC組和CUS模型組,每組16只。CUS模型建立后分別在0周和8周時(shí),首先采用MRI、HE染色等方法評(píng)價(jià)單純慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激是否引起椎間盤的退變。隨后采用實(shí)時(shí)熒光定量q PCR和免疫組化對(duì)髓核組織中蛋白多糖(Aggrecan)、II型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和-3(MMP-1、MMP-3)的m RNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),采用TUNEL法檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率,免疫組化測(cè)髓核IL-1β的表達(dá)。與NC組進(jìn)行比較,探討慢性應(yīng)激對(duì)椎間盤退變的影響及作用機(jī)制;第三部分:24只Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組,即NC組8只和CUS模型組16只,后者再分為模型組和積極應(yīng)對(duì)組,每組8只。采用HE染色評(píng)估椎間盤的退變程度,TUNEL法檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率,Western-blot檢測(cè)髓核TGF-β1、IL-1β、NF-κB(p-IκB、P65)的表達(dá)。組間比較,探討積極應(yīng)對(duì)慢性應(yīng)激對(duì)椎間盤再生的作用及其機(jī)制。結(jié)果:第一部分:造模21天后大鼠行為表現(xiàn)符合CUS模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。慢性應(yīng)激起始階段(0周時(shí)),兩組穿刺椎間盤的MRI和HE染色的表現(xiàn)相似并正常,改良Pfirrmann分級(jí)和組織學(xué)評(píng)分均無明顯統(tǒng)計(jì)差異(p?0.05)。2周時(shí),單穿纖維環(huán)穿刺組表現(xiàn)輕度影像學(xué)和組織學(xué)上的退變,而CUS載體纖維環(huán)穿刺組達(dá)到中度椎間盤退變,平均Pfirrmann分級(jí)和組織學(xué)評(píng)分明顯高于單純纖維環(huán)穿刺組(p0.05)。4周時(shí),MRI檢查顯示,單純纖維環(huán)穿刺組Pfirrmann分級(jí)主要為2-3級(jí),CUS載體纖維環(huán)穿刺組為3-4級(jí)。組織學(xué)檢查顯示,單純纖維環(huán)穿刺組的椎間盤表現(xiàn)為中度退邊,而CUS載體纖維環(huán)穿刺組椎間盤達(dá)到重度退變。兩組Pfirrmann分級(jí)和組織學(xué)評(píng)分均有明顯統(tǒng)計(jì)差異(p0.05)。8周時(shí),兩組穿刺椎間盤在影像和組織學(xué)上均呈現(xiàn)嚴(yán)重退變表現(xiàn),但CUS載體纖維環(huán)穿刺組的平均Pfirrmann分級(jí)和組織學(xué)評(píng)分仍高于單純纖維環(huán)穿刺組(p0.05);第二部分:MRI檢查和HE染色結(jié)果顯示,在慢性應(yīng)激起始點(diǎn)(0周時(shí)),椎間盤無明顯影像學(xué)和組織學(xué)退變跡象,與NC比較平均組織學(xué)評(píng)分無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p?0.05)。8周時(shí),CUS模型呈現(xiàn)髓核面積縮小、水分丟失等影像學(xué)的退變。HE染色示髓核細(xì)胞數(shù)量減少,體積縮小、呈類軟骨樣細(xì)胞,髓核纖維化、結(jié)構(gòu)紊亂。兩組平均組織學(xué)評(píng)分有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。PCR結(jié)果顯示,0周時(shí)兩組Aggrecan、II型膠原蛋白的m RNA表達(dá)水平較高、MMP-1、MMP-3的m RNA表達(dá)水平較低,每個(gè)指標(biāo)組間比較無明顯統(tǒng)計(jì)差異(p?0.05)。8周時(shí),CUS模型組髓核中Aggrecan、II型膠原蛋白的m RNA表達(dá)水平明顯降低,而MMP-1、MMP-3的m RNA水平升高,與NC組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。TUNEL染色示,8周時(shí)CUS模型組的髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高,與NC組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。免疫組化示,0周時(shí)兩組髓核組織Aggrecan、II型膠原蛋白的表達(dá)均較高,MMP-1、MMP-3及IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)比例較低,兩組無明顯差異(p?0.05)。8周時(shí),CUS組的Aggrecan和II型膠原蛋白的表達(dá)明顯降低,MMP-1、MMP-3、IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)比例顯著升高,與NC組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);第三部分:HE染色,CUS模型組呈現(xiàn)明顯的組織學(xué)上的退變,而積極應(yīng)對(duì)組的椎間盤退變不明顯,平均組織學(xué)評(píng)分與模型組比較,有明顯差異(p0.05),與NC組比較無明顯差異(p?0.05)。TUNEL染色,模型組髓核細(xì)胞凋亡率明顯升高,與NC有明顯差異(p0.05)。積極應(yīng)對(duì)組髓核細(xì)胞凋亡率雖然與NC組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但與模型組比較細(xì)胞凋亡明顯減少(p0.05)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組髓核中NF-κB、IL-1β的表達(dá)升高,TGF-β1表達(dá)降低,積極應(yīng)對(duì)組中NF-κB和IL-1β的表達(dá)量明顯降低,TGF-β1表達(dá)量升高。積極應(yīng)對(duì)組TGF-β1、NF-κB、IL-1β的灰度比值與模型組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:第一部分,慢性不可預(yù)知性應(yīng)激刺激能夠促進(jìn)纖維環(huán)穿刺誘導(dǎo)的椎間盤退變的進(jìn)展;第二部分,慢性應(yīng)激在早期階段對(duì)椎間盤不產(chǎn)生明顯的影響,髓核處于正常代謝狀態(tài),炎癥因子的表達(dá)較低。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),慢性應(yīng)激狀態(tài)在髓核中促進(jìn)炎癥因子和基質(zhì)降解酶的表達(dá),加速髓核細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的分解,抑制Aggrecan、II型膠原等主要基質(zhì)蛋白的合成,從而降低髓核細(xì)胞外基質(zhì)的含量,使椎間盤的組織形態(tài)逐漸發(fā)生改變,進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤的退變;第三部分,積極應(yīng)對(duì)慢性應(yīng)激狀態(tài)通過促進(jìn)TGF-β1的表達(dá),抑制NF-κB通路的途徑,降低髓核細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞的代謝活性,從而能夠促進(jìn)椎間盤的再生。
【圖文】：

1.2.2 技術(shù)路線圖1.2.3 慢性不可預(yù)知性應(yīng)激模型的建立采用如下 10 種刺激作為應(yīng)激原，每天隨機(jī)抽取 1-2 種作用于大鼠，使之無法預(yù)知何種刺激將要發(fā)生，，并且同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。（1）高速水平震蕩：第 1 周，按照 120 次/min，持續(xù) 45min；第 2 周，應(yīng)激持續(xù) 60min；第 3 周，應(yīng)激持續(xù) 90min。（2）足底電刺激：第 1 周，電壓 35V

15圖 2 大鼠尾椎間盤解剖位置Fig.2 The anatomical position of rat tail intervertebral discs
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681.5

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3 劉q

本文編號(hào)：2645976