【摘要】：脊髓損傷是中樞神經系統(tǒng)的嚴重創(chuàng)傷,一旦發(fā)生,往往造成患者終身殘疾,給家庭和社會帶來沉重的負擔。繼發(fā)性炎癥反應在脊髓損傷的病程中起著重要的作用,其引發(fā)的一系列病理反應嚴重阻礙損傷修復的進程。在參與繼發(fā)性炎癥反應的眾多細胞中,骨髓源性巨噬細胞扮演著關鍵角色,其占據損傷中央區(qū),持續(xù)炎性分泌,最終導致了組織不可逆轉的壞死、凋亡。巨噬細胞具有極化的特性,在不同的刺激下,可極化為具有細胞毒性的M1型細胞或具有抑炎促修復作用的M2型細胞,發(fā)揮不同的生物學作用。在脊髓損傷的病程中,具有細胞毒性的M1型巨噬細胞占據主導,而M2型細胞僅一過性增高,這種特殊的極化狀態(tài),進一步導致了脊髓的不可逆損傷。前期大量研究證明,通過改變脊髓損傷過程中巨噬細胞極化的狀態(tài),抑制M1型細胞的主導地位,可有效地促進脊髓損傷的修復。弱激光治療是指利用低輻照度激光的生物學效用,進行局部照射,產生抑炎促修復作用的一種無創(chuàng)性治療手段,目前在臨床多個領域已廣泛應用。前期大量研究證明,利用810nm的弱激光進行照射,可顯著提高脊髓損傷動物運動功能的恢復,促進神經元存活,抑制損傷區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-6等的分泌,同時,相關研究也發(fā)現,810nm弱激光照射可顯著下調損傷區(qū)M1型巨噬細胞數量,上調M2型巨噬細胞比例。但弱激光能否直接作用于脊髓損傷病程中的關鍵細胞—骨髓源性巨噬細胞,調控其極化表型,改變其分泌狀況,這些問題尚不明確。為了回答以上問題,開展如下兩部分實驗研究。實驗一:弱激光照射對M1型骨髓源性巨噬細胞活力及極化狀態(tài)的影響目的:研究弱激光治療對M1型骨髓源性巨噬細胞活性及極化的作用方法:使用Balb/c小鼠提取原代骨髓源性巨噬細胞,培養(yǎng)基中加入100ng/ml LPS和20ng/mL IFN-γ對其進行極化刺激,采用流式細胞術觀察極化情況,獲得成熟的M1型細胞。將M1型細胞隨機分為照射組與對照組:照射組采用固定功率密度參數(2mW/cm~2)及照射面積(4.5cm~2),通過調整不同的照射時長,獲得0.4J(44s)、4J(440s)及10J(1111s)三個能量組;對照組置于暗箱,不進行照射。照射后2、24小時,使用CCK 8法檢測細胞活性。在照射后6小時,使用RT-qPCR法檢測M1型細胞表面標志物iNOS的mRNA表達,照射后24小時,使用免疫印跡法及免疫熒光形態(tài)學染色對iNOS蛋白層面的表達進行檢測。結果:弱激光照射后2小時,各組間細胞活性未出現顯著變化,照射后24小時,4J組細胞活性顯著增強,高于對照組及其他照射組。弱激光照射后6小時,激光照射組iNOS的mRNA表達較對照組顯著下降;照射后24小時,0.4J組及4J組iNOS蛋白表達較對照組顯著下降,而10J組則未發(fā)現顯著差異。結論:本實驗所采用的弱激光可以提高M1型骨髓源性巨噬細胞的活性,抑制其極化的表達,且這種作用具有一定的時間、劑量依賴性。實驗二:弱激光照射對M1型骨髓源性巨噬細胞分泌的影響及機制研究目的:研究弱激光對M1型骨髓源性巨噬細胞分泌的影響及相應機制方法:將培養(yǎng)成熟的M1型細胞隨機分為弱激光照射組及對照組,激光參數同實驗一。照射后6小時使用RT-qPCR法對促炎因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的mRNA進行檢測。照射后24小時使用酶聯免疫吸附試驗對TNF-α、IL-1β、MCP-1以及神經營養(yǎng)因子BDNF和NGF的分泌進行檢測。照射后2小時及24小時使用ROS探針對M1型細胞的ROS含量進行檢測。使用免疫熒光形態(tài)學染色,對采用弱激光-M1型巨噬細胞上清液過繼培養(yǎng)的背根神經節(jié)細胞軸突進行染色。使用免疫印跡法,檢測經典極化通路NF-κB p65、Phospho NF-κB p65的表達。結果:弱激光照射后6小時,相較對照組,0.4J及4J組TNF-α及IL-1β的mRNA表達顯著下降;而對比對照組,弱激光未顯著改變MCP-1的mRNA表達。照射后24小時檢測發(fā)現,相比對照組,0.4J組的照射可以顯著抑制IL-1β的分泌,上調MCP-1的分泌;4J組中,TNF-α、IL-1β的分泌顯著下調,MCP-1、BDNF及NGF分泌顯著上升,經典極化轉錄因子NF-κB p65、Phospho NF-κB p65的表達受到明顯抑制;10J組的照射,可以顯著抑制TNF-α的分泌。ROS探針的檢測發(fā)現,照射后2小時,10J組ROS含量較其他組顯著上升,而24小時后,4J組ROS含量顯著低于對照組及10J組。過繼培養(yǎng)背根神經節(jié)細胞24小時后,相較對照組,4J組及10J組上清液可顯著促進背根神經節(jié)細胞軸突的生長。結論:,本實驗應用的弱激光可以直接作用于M1型骨髓源性巨噬細胞,抑制其炎性分泌,下調氧化應激反應,上調神經營養(yǎng)因子的分泌,促進神經軸突的生長,且弱激光調控巨噬細胞極化和分泌的作用,可能與其下調經典極化通路NF-κB p65/Phospho NF-κB p65表達有關。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學碩士學位論文-16-圖1. 脊髓損傷后參與反應的不同類型白細胞（摘自：AkhtarAM.et.al. Front CellNeurosci, 2016, 10(98):1-24.）3 巨噬細胞在脊髓損傷中的重要作用巨噬細胞隸屬于單核巨噬系統(tǒng)，源于骨髓中的前體細胞，主要包括包括單核細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞。巨噬細胞分布廣泛，大體分為循環(huán)巨噬細胞和組織巨噬細胞。在正常的生理過程中，巨噬細胞主要發(fā)揮免疫監(jiān)視、吞噬死亡細胞、維持組織穩(wěn)態(tài)的作用。當機體環(huán)境受到損害時，巨噬細胞能夠迅速做出反應，參與特異性及非特異性免疫。脊髓組織中特異的巨噬細胞為小膠質細胞，分化自髓系祖細胞，并定植于脊髓組織內部，在脊髓組織的發(fā)育及免疫監(jiān)視中起著重要的作用。而當損傷發(fā)生時，來自外周血的骨髓源性巨噬細胞會從損傷的血管大量侵入脊髓，參與脊髓損傷的病理過程

空軍軍醫(yī)大學碩士學位論文的形成。近期研究發(fā)現，，巨噬細胞在不同的免疫微環(huán)境下，會分化為主的巨噬細胞和以抑炎促修復為主的巨噬/小膠質細胞，稱為巨噬噬細胞主要可以分為具有促炎及神經毒性作用的 M1 型巨噬細胞，型巨噬細胞（ClassicallyActivated Macrophage, CAM）和具有抗炎促活化型巨噬細胞（Alternativly Activated Macrophage, AAM）及未激細胞和腫瘤相關型巨噬細胞（TumorAssociated Macrophage, TAM）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2

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