【摘要】：脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷,一旦發(fā)生,往往造成患者終身殘疾,給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。繼發(fā)性炎癥反應(yīng)在脊髓損傷的病程中起著重要的作用,其引發(fā)的一系列病理反應(yīng)嚴(yán)重阻礙損傷修復(fù)的進(jìn)程。在參與繼發(fā)性炎癥反應(yīng)的眾多細(xì)胞中,骨髓源性巨噬細(xì)胞扮演著關(guān)鍵角色,其占據(jù)損傷中央?yún)^(qū),持續(xù)炎性分泌,最終導(dǎo)致了組織不可逆轉(zhuǎn)的壞死、凋亡。巨噬細(xì)胞具有極化的特性,在不同的刺激下,可極化為具有細(xì)胞毒性的M1型細(xì)胞或具有抑炎促修復(fù)作用的M2型細(xì)胞,發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。在脊髓損傷的病程中,具有細(xì)胞毒性的M1型巨噬細(xì)胞占據(jù)主導(dǎo),而M2型細(xì)胞僅一過性增高,這種特殊的極化狀態(tài),進(jìn)一步導(dǎo)致了脊髓的不可逆損傷。前期大量研究證明,通過改變脊髓損傷過程中巨噬細(xì)胞極化的狀態(tài),抑制M1型細(xì)胞的主導(dǎo)地位,可有效地促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。弱激光治療是指利用低輻照度激光的生物學(xué)效用,進(jìn)行局部照射,產(chǎn)生抑炎促修復(fù)作用的一種無創(chuàng)性治療手段,目前在臨床多個(gè)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用。前期大量研究證明,利用810nm的弱激光進(jìn)行照射,可顯著提高脊髓損傷動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),促進(jìn)神經(jīng)元存活,抑制損傷區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-6等的分泌,同時(shí),相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn),810nm弱激光照射可顯著下調(diào)損傷區(qū)M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量,上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞比例。但弱激光能否直接作用于脊髓損傷病程中的關(guān)鍵細(xì)胞—骨髓源性巨噬細(xì)胞,調(diào)控其極化表型,改變其分泌狀況,這些問題尚不明確。為了回答以上問題,開展如下兩部分實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)一:弱激光照射對M1型骨髓源性巨噬細(xì)胞活力及極化狀態(tài)的影響目的:研究弱激光治療對M1型骨髓源性巨噬細(xì)胞活性及極化的作用方法:使用Balb/c小鼠提取原代骨髓源性巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)基中加入100ng/ml LPS和20ng/mL IFN-γ對其進(jìn)行極化刺激,采用流式細(xì)胞術(shù)觀察極化情況,獲得成熟的M1型細(xì)胞。將M1型細(xì)胞隨機(jī)分為照射組與對照組:照射組采用固定功率密度參數(shù)(2mW/cm~2)及照射面積(4.5cm~2),通過調(diào)整不同的照射時(shí)長,獲得0.4J(44s)、4J(440s)及10J(1111s)三個(gè)能量組;對照組置于暗箱,不進(jìn)行照射。照射后2、24小時(shí),使用CCK 8法檢測細(xì)胞活性。在照射后6小時(shí),使用RT-qPCR法檢測M1型細(xì)胞表面標(biāo)志物iNOS的mRNA表達(dá),照射后24小時(shí),使用免疫印跡法及免疫熒光形態(tài)學(xué)染色對iNOS蛋白層面的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果:弱激光照射后2小時(shí),各組間細(xì)胞活性未出現(xiàn)顯著變化,照射后24小時(shí),4J組細(xì)胞活性顯著增強(qiáng),高于對照組及其他照射組。弱激光照射后6小時(shí),激光照射組iNOS的mRNA表達(dá)較對照組顯著下降;照射后24小時(shí),0.4J組及4J組iNOS蛋白表達(dá)較對照組顯著下降,而10J組則未發(fā)現(xiàn)顯著差異。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)所采用的弱激光可以提高M(jìn)1型骨髓源性巨噬細(xì)胞的活性,抑制其極化的表達(dá),且這種作用具有一定的時(shí)間、劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)二:弱激光照射對M1型骨髓源性巨噬細(xì)胞分泌的影響及機(jī)制研究目的:研究弱激光對M1型骨髓源性巨噬細(xì)胞分泌的影響及相應(yīng)機(jī)制方法:將培養(yǎng)成熟的M1型細(xì)胞隨機(jī)分為弱激光照射組及對照組,激光參數(shù)同實(shí)驗(yàn)一。照射后6小時(shí)使用RT-qPCR法對促炎因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的mRNA進(jìn)行檢測。照射后24小時(shí)使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對TNF-α、IL-1β、MCP-1以及神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NGF的分泌進(jìn)行檢測。照射后2小時(shí)及24小時(shí)使用ROS探針對M1型細(xì)胞的ROS含量進(jìn)行檢測。使用免疫熒光形態(tài)學(xué)染色,對采用弱激光-M1型巨噬細(xì)胞上清液過繼培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突進(jìn)行染色。使用免疫印跡法,檢測經(jīng)典極化通路NF-κB p65、Phospho NF-κB p65的表達(dá)。結(jié)果:弱激光照射后6小時(shí),相較對照組,0.4J及4J組TNF-α及IL-1β的mRNA表達(dá)顯著下降;而對比對照組,弱激光未顯著改變MCP-1的mRNA表達(dá)。照射后24小時(shí)檢測發(fā)現(xiàn),相比對照組,0.4J組的照射可以顯著抑制IL-1β的分泌,上調(diào)MCP-1的分泌;4J組中,TNF-α、IL-1β的分泌顯著下調(diào),MCP-1、BDNF及NGF分泌顯著上升,經(jīng)典極化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65、Phospho NF-κB p65的表達(dá)受到明顯抑制;10J組的照射,可以顯著抑制TNF-α的分泌。ROS探針的檢測發(fā)現(xiàn),照射后2小時(shí),10J組ROS含量較其他組顯著上升,而24小時(shí)后,4J組ROS含量顯著低于對照組及10J組。過繼培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞24小時(shí)后,相較對照組,4J組及10J組上清液可顯著促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的生長。結(jié)論:,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的弱激光可以直接作用于M1型骨髓源性巨噬細(xì)胞,抑制其炎性分泌,下調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng),上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長,且弱激光調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和分泌的作用,可能與其下調(diào)經(jīng)典極化通路NF-κB p65/Phospho NF-κB p65表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文-16-圖1. 脊髓損傷后參與反應(yīng)的不同類型白細(xì)胞（摘自：AkhtarAM.et.al. Front CellNeurosci, 2016, 10(98):1-24.）3 巨噬細(xì)胞在脊髓損傷中的重要作用巨噬細(xì)胞隸屬于單核巨噬系統(tǒng)，源于骨髓中的前體細(xì)胞，主要包括包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。巨噬細(xì)胞分布廣泛，大體分為循環(huán)巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞。在正常的生理過程中，巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮免疫監(jiān)視、吞噬死亡細(xì)胞、維持組織穩(wěn)態(tài)的作用。當(dāng)機(jī)體環(huán)境受到損害時(shí)，巨噬細(xì)胞能夠迅速做出反應(yīng)，參與特異性及非特異性免疫。脊髓組織中特異的巨噬細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞，分化自髓系祖細(xì)胞，并定植于脊髓組織內(nèi)部，在脊髓組織的發(fā)育及免疫監(jiān)視中起著重要的作用。而當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)，來自外周血的骨髓源性巨噬細(xì)胞會(huì)從損傷的血管大量侵入脊髓，參與脊髓損傷的病理過程

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文的形成。近期研究發(fā)現(xiàn)，，巨噬細(xì)胞在不同的免疫微環(huán)境下，會(huì)分化為主的巨噬細(xì)胞和以抑炎促修復(fù)為主的巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞，稱為巨噬噬細(xì)胞主要可以分為具有促炎及神經(jīng)毒性作用的 M1 型巨噬細(xì)胞，型巨噬細(xì)胞（ClassicallyActivated Macrophage, CAM）和具有抗炎促活化型巨噬細(xì)胞（Alternativly Activated Macrophage, AAM）及未激細(xì)胞和腫瘤相關(guān)型巨噬細(xì)胞（TumorAssociated Macrophage, TAM）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2

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本文編號：2617232