發(fā)布時(shí)間：2020-04-03 04:26

【摘要】：背景和目的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎早期病程中的軟骨細(xì)胞是炎性軟骨細(xì)胞。抑制軟骨細(xì)胞炎癥、促進(jìn)其修復(fù)再生是治療早期骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞退變的兩個(gè)重要機(jī)制,但目前尚不清楚兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。我們前期研究發(fā)現(xiàn),脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose derived mesenchymal stem cells ADMSCs)可抑制炎癥反應(yīng)而滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(Synovium derived mesenchymal stem cells SDMSCs)可再生軟骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)探討聯(lián)合應(yīng)用脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞及滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎性軟骨細(xì)胞的退變具有協(xié)同抑制作用。方法原代培養(yǎng)脂肪和滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞。體外二維培養(yǎng)條件下,MTS(細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn))檢測(cè)三種細(xì)胞的增殖情況。通過(guò)定量PCR及免疫熒光分析三種貼壁細(xì)胞基因水平及蛋白水平的成軟骨標(biāo)志物的差異。體外三維混合培養(yǎng)條件下,分三組:1.ADMSCs+炎性軟骨細(xì)胞組(A+C組)2.SDMSCs+炎性軟骨細(xì)胞組(S+C組)3.ADMSCs-SDMSCs+炎性軟骨細(xì)胞組(A+S+C組)�；旌吓囵B(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊石蠟切片做Alcian blue(阿爾新藍(lán))、Safranin O(番紅O)染色及II型膠原免疫組化染色,并做定量分析,收集三組細(xì)胞團(tuán)塊作定量PCR檢測(cè)成軟骨分化的標(biāo)志物,同時(shí)消化細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。收集不同時(shí)間段的培養(yǎng)液上清通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測(cè)促炎及抗炎因子的分泌情況。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)表示,用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用成組t檢驗(yàn)分析定量資料,縱向組間差異比較應(yīng)用多樣本均數(shù)單因素方差分析。結(jié)果通過(guò)MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADMSCs的增殖速率炎性軟骨細(xì)胞和SDMSCs,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)條件下,炎性軟骨細(xì)胞的成軟骨標(biāo)志物II型膠原及蛋白聚糖表達(dá)量明顯高于另外兩種細(xì)胞(P0.01)。細(xì)胞爬片II型膠原免疫熒光定量分析炎性軟骨細(xì)胞組明顯高于另外兩組(P0.01)。A+S+C組的成軟骨分化的特異性染色均明顯高于另外兩組(阿爾新藍(lán)染色A+C組6.2±0.1,S+C組36.2±0.21,A+S+C組54.7±0.43番紅O染色,A+C組14.2±0.15,S+C組37.7±0.4,A+S+C組58.8±0.13 II型膠原免疫組化A+C組13.6±0.24,S+C組30.1±0.35,A+S+C組54.6±0.27)(P0.05)。收集3D培養(yǎng)細(xì)胞上清,ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1,IL-6,TNFα在S+C組明顯高于A+C組及A+S+C組,抗炎因子IL-10在A+C組及A+S+C組明顯高于S+C組且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。細(xì)胞團(tuán)塊作定量PCR發(fā)現(xiàn)成軟骨分化標(biāo)志物蛋白聚糖及II型膠原表達(dá)量為:A+S+C組明顯高于另外兩組,且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。細(xì)胞團(tuán)塊消化計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn):14d后A+S+C組S+C組A+C組,且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1.體外二維培養(yǎng)條件下,滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力差。2.體外3D培養(yǎng)條件下,滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的成軟骨分化的能力,脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗炎作用。3.聯(lián)合應(yīng)用脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞和滑膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎性軟骨細(xì)胞退變具有協(xié)同抑制作用。
【圖文】：

圖 1A 顯示 ADMSCs、SDMSCs、炎性軟骨細(xì)胞在不同倍數(shù)顯微鏡（40X、200X）下 1B 顯示三種貼壁細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況，通過(guò) MTS 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)dADMSCs 和 SDMSCs 的增殖速率開(kāi)始大于炎性軟骨細(xì)胞，（ADMSCs1.3±0.2，SDMS.1±0.1，炎性軟骨細(xì)胞 0.7±0.1）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。但是前兩者之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)異（P＞0.05），從第 4d 開(kāi)始三種細(xì)胞的增殖速率 ADMSCs＞SDMSCs＞炎性軟骨細(xì)胞ADMSCs 1.65±0.1，SDMSCs 1.3±0.2，炎性軟骨細(xì)胞 1.0±0.1），結(jié)果具有明顯的統(tǒng)計(jì)

圖 2A 及 2B 顯示炎性軟骨細(xì)胞的成軟骨標(biāo)志物 II 型膠原蛋白及蛋白聚糖在 mRNA 水平的表達(dá)量要高于 SDMSCs 和 ADMSCs，（圖 2A. ADMSCs 0.0021±0.00024，SDMSCs0.0024±0.00011，炎性軟骨細(xì)胞 0.0054±0.00021。圖 2B.ADMSCs 0.18±0.02，，SDMSCs 0.19±0.01，炎性軟骨細(xì)胞 0.52±0.014）且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。圖 C 顯示三種細(xì)胞II 型膠原免疫熒光染色的顯微鏡下觀（40X），通過(guò)圖 D 的定量分析顯示炎性軟骨細(xì)胞在蛋白水平表達(dá)的 II 型膠原明顯高于 SDMSCs 和 ADMSCs（ADMSCs 0.92±0.03，SDMSCs9.47±0.05，炎癥軟骨細(xì)胞 78.64±0.07），具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），而 SDMSCs
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R684.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Justin D Glenn;Katharine A Whartenby;;Mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy[J];World Journal of Stem Cells;2014年05期

本文編號(hào)：2612933