【摘要】：【目的】脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是中樞神經系統損傷中最復雜多變的病理過程之一,其治療方法一直是研究的熱點和難題。研究已證實間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的移植能夠促進動物模型中受損脊髓組織的修復,但其功能十分有限。MSCs具有低免疫原性、多向分化潛能及較強的自我更新能力,可用于治療多種疾病,其功能受多種細胞因子、轉錄因子、信號通路和micro RNA(mi RNA)的調控。mi R124及mi R21-5p均與神經細胞的功能密切相關。本研究探索mi R124和mi R21-5p在MSCs的遷移、增殖和向神經分化中的作用,并進一步探討MSCs移植在修復SCI中的作用�！痉椒ā渴褂萌撬栀N壁培養(yǎng)法從SD大鼠的骨髓中分離、培養(yǎng)MSCs,并在體外擴增至P3-P5代用于進一步實驗。將MSCs分為空白對照組(NC-MSCs),并使用Lipofectamine 2000分別將mi RNA-mimics control、mi R124-mimics和mi R21-5p-mimics轉染到MSC中,分別定義為轉染對照組(MC-MSCs)、mi R124-MSCs組和mi R21-5p-MSCs組。通過細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力。使用含EDU的培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs并通過免疫熒光染色檢測各組細胞的增殖能力。使用含β-巰基乙醇誘(Beta-mercaptoethanol,β-ME)及丁基羥基茴香醚(Butylhydroxyanisole,BHA)的誘導分化培養(yǎng)基誘導MSCs向神經細胞方向分化,并通過細胞免疫熒光化學染色方法檢測誘導后細胞的神經元標志蛋白TUJ-1及NEUN的表達。使用動脈瘤鉗夾法制備大鼠脊髓損傷模型,CM-Dil或EDU體外標記MSCs,通過尾靜脈注射或腰椎穿刺的方法移植MSCs進入大鼠體內。取大鼠脊髓組織冰凍切片后進行組織免疫熒光化學染色,觀察并檢測移植后的細胞數量及向神經分化的情況�！窘Y果】通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法可方便獲取大量MSCs。通過β-ME和BHA的誘導方法可以在體外成功誘導MSCs向神經細胞方向分化。使用Lipofectamine 2000結合mi R124-mimics或mi R21-5p-mimics,可以獲得高表達mi R124或mi R21-5p的MSCs。Mi R124的過表達可以促進MSCs的遷移和向神經細胞方向分化,但對細胞增殖無明顯作用。過表達mi R21-5p可以促進MSCs的增殖和向神經細胞方向分化,但對細胞遷移無明顯作用。鉗夾法制備大鼠脊髓損傷模型具有操作簡單、損傷確切、可定量、重復性高、術后模型動物死亡率低的優(yōu)點。CM-Dil可在體內外有效熒光標記MSCs。通過尾靜脈注射及腰椎穿刺注射的方法均可成功移植MSCs進入損傷脊髓處,且腰椎穿刺法移植MSCs可在脊髓損傷處獲得更多的移植細胞。同時,移植細胞可分化為GFAP陽性細胞�！窘Y論】通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取的MSCs可在體外分化為神經元樣細胞。mi R124可以提高MSCs的遷移和向神經細胞方向分化的能力。mi R21-5p可以提高MSCs的增殖和向神經細胞方向分化的能力。CM-Dil可在體內外有效熒光標記MSCs。腰椎穿刺法較尾靜脈注射法移植MSCs可在脊髓損傷處獲得更多的移植細胞,且移植后細胞可成功遷移至脊髓損傷處并向神經組織分化,對于進一步修復脊髓損傷有重要意義。
【圖文】：

MicroRNA124 和 microRNA21-5p 促進間充質干細胞遷移、增殖及向神經分化的體內外研究 第一部分1.2.8 統計學分析：統計學方法：所有數據以平均值±S.E.M 表示，采用 Prime 軟件進行統計分析使用 t 檢驗用于確定不同實驗組之間的統計學差異，顯著性差異設置為 P <0.05（* <0.05; **P <0.01; ***P <0.001）。1.3 結果1.3.1 MSCs 體外分離及培養(yǎng)接種 3 小時后細胞開始附著于培養(yǎng)皿底。 72 小時后更換培養(yǎng)基后附著的細胞數量增加。培養(yǎng)細胞 5 天，每 48 小時更換一次培養(yǎng)基，大部分細胞呈螺旋狀生長的紡錘形，只有少數細胞呈三角形。三次傳代后，觀察到形態(tài)學均一的成纖維細胞樣細胞群。即使經過十次傳代后，細胞仍保持和第三代細胞一樣的呈梭形纖維狀的細胞形態(tài)大量細胞聚集呈旋渦狀生長（圖 1）。

第一部分 MicroRNA124 和 microRNA21-5p 促進間充質干細胞遷移、增殖及向神經分化的體內外研呈梭形纖維狀的細胞形態(tài)，大量細胞聚集呈旋渦狀生長。(比例尺= 100μm)1.3.2 誘導 MSCs 向神經元樣細胞分化使用前文方法中的 1.2.6 的誘導方案誘導 MSCs 細胞向神經細胞方向分化。有不同比例的細胞成功向神經元方向分化，其比例通常超過 46.8％（圖 2）。誘導處理 小時后，，固定細胞，并對其進行神經元標記物 TUJ-1（圖 3）和 NEUN（圖 4）染色，確定分化后細胞中神經細胞的比例。大多數誘導后的MSCs表現神經細胞形態(tài)，NEU陽性（44.7％±13.2％）和 TUJ-1 陽性（52.7％±12.4％）。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2

【參考文獻】

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1 Defeng Zou;Yi Chen;Yaxin Han;Chen Lv;Guanjun Tu;;Overexpression of microRNA-124 promotes the neuronal differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J];Neural Regeneration Research;2014年12期

2 Yuxin Ni;Kaizhi Zhang;Xuejuan Liu;Tingting Yang;Baixiang Wang;Li Fu;Lan A;Yanmin Zhou;;miR-21 promotes the differentiation of hair folliclederived neural crest stem cells into Schwann cells[J];Neural Regeneration Research;2014年08期

本文編號：2603593