發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 00:01

【摘要】：【目的】脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中最復(fù)雜多變的病理過(guò)程之一,其治療方法一直是研究的熱點(diǎn)和難題。研究已證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的移植能夠促進(jìn)動(dòng)物模型中受損脊髓組織的修復(fù),但其功能十分有限。MSCs具有低免疫原性、多向分化潛能及較強(qiáng)的自我更新能力,可用于治療多種疾病,其功能受多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路和micro RNA(mi RNA)的調(diào)控。mi R124及mi R21-5p均與神經(jīng)細(xì)胞的功能密切相關(guān)。本研究探索mi R124和mi R21-5p在MSCs的遷移、增殖和向神經(jīng)分化中的作用,并進(jìn)一步探討MSCs移植在修復(fù)SCI中的作用�！痉椒ā渴褂萌撬栀N壁培養(yǎng)法從SD大鼠的骨髓中分離、培養(yǎng)MSCs,并在體外擴(kuò)增至P3-P5代用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。將MSCs分為空白對(duì)照組(NC-MSCs),并使用Lipofectamine 2000分別將mi RNA-mimics control、mi R124-mimics和mi R21-5p-mimics轉(zhuǎn)染到MSC中,分別定義為轉(zhuǎn)染對(duì)照組(MC-MSCs)、mi R124-MSCs組和mi R21-5p-MSCs組。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力。使用含EDU的培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs并通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。使用含β-巰基乙醇誘(Beta-mercaptoethanol,β-ME)及丁基羥基茴香醚(Butylhydroxyanisole,BHA)的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,并通過(guò)細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色方法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞的神經(jīng)元標(biāo)志蛋白TUJ-1及NEUN的表達(dá)。使用動(dòng)脈瘤鉗夾法制備大鼠脊髓損傷模型,CM-Dil或EDU體外標(biāo)記MSCs,通過(guò)尾靜脈注射或腰椎穿刺的方法移植MSCs進(jìn)入大鼠體內(nèi)。取大鼠脊髓組織冰凍切片后進(jìn)行組織免疫熒光化學(xué)染色,觀察并檢測(cè)移植后的細(xì)胞數(shù)量及向神經(jīng)分化的情況�！窘Y(jié)果】通過(guò)全骨髓貼壁培養(yǎng)法可方便獲取大量MSCs。通過(guò)β-ME和BHA的誘導(dǎo)方法可以在體外成功誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。使用Lipofectamine 2000結(jié)合mi R124-mimics或mi R21-5p-mimics,可以獲得高表達(dá)mi R124或mi R21-5p的MSCs。Mi R124的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)MSCs的遷移和向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,但對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯作用。過(guò)表達(dá)mi R21-5p可以促進(jìn)MSCs的增殖和向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,但對(duì)細(xì)胞遷移無(wú)明顯作用。鉗夾法制備大鼠脊髓損傷模型具有操作簡(jiǎn)單、損傷確切、可定量、重復(fù)性高、術(shù)后模型動(dòng)物死亡率低的優(yōu)點(diǎn)。CM-Dil可在體內(nèi)外有效熒光標(biāo)記MSCs。通過(guò)尾靜脈注射及腰椎穿刺注射的方法均可成功移植MSCs進(jìn)入損傷脊髓處,且腰椎穿刺法移植MSCs可在脊髓損傷處獲得更多的移植細(xì)胞。同時(shí),移植細(xì)胞可分化為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞�！窘Y(jié)論】通過(guò)全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取的MSCs可在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。mi R124可以提高M(jìn)SCs的遷移和向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的能力。mi R21-5p可以提高M(jìn)SCs的增殖和向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的能力。CM-Dil可在體內(nèi)外有效熒光標(biāo)記MSCs。腰椎穿刺法較尾靜脈注射法移植MSCs可在脊髓損傷處獲得更多的移植細(xì)胞,且移植后細(xì)胞可成功遷移至脊髓損傷處并向神經(jīng)組織分化,對(duì)于進(jìn)一步修復(fù)脊髓損傷有重要意義。
【圖文】：

MicroRNA124 和 microRNA21-5p 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移、增殖及向神經(jīng)分化的體內(nèi)外研究 第一部分1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)以平均值±S.E.M 表示，采用 Prime 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析使用 t 檢驗(yàn)用于確定不同實(shí)驗(yàn)組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯著性差異設(shè)置為 P <0.05（* <0.05; **P <0.01; ***P <0.001）。1.3 結(jié)果1.3.1 MSCs 體外分離及培養(yǎng)接種 3 小時(shí)后細(xì)胞開(kāi)始附著于培養(yǎng)皿底。 72 小時(shí)后更換培養(yǎng)基后附著的細(xì)胞數(shù)量增加。培養(yǎng)細(xì)胞 5 天，每 48 小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，大部分細(xì)胞呈螺旋狀生長(zhǎng)的紡錘形，只有少數(shù)細(xì)胞呈三角形。三次傳代后，觀察到形態(tài)學(xué)均一的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞群。即使經(jīng)過(guò)十次傳代后，細(xì)胞仍保持和第三代細(xì)胞一樣的呈梭形纖維狀的細(xì)胞形態(tài)大量細(xì)胞聚集呈旋渦狀生長(zhǎng)（圖 1）。

第一部分 MicroRNA124 和 microRNA21-5p 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移、增殖及向神經(jīng)分化的體內(nèi)外研呈梭形纖維狀的細(xì)胞形態(tài)，大量細(xì)胞聚集呈旋渦狀生長(zhǎng)。(比例尺= 100μm)1.3.2 誘導(dǎo) MSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化使用前文方法中的 1.2.6 的誘導(dǎo)方案誘導(dǎo) MSCs 細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化。有不同比例的細(xì)胞成功向神經(jīng)元方向分化，其比例通常超過(guò) 46.8％（圖 2）。誘導(dǎo)處理 小時(shí)后，，固定細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)記物 TUJ-1（圖 3）和 NEUN（圖 4）染色，確定分化后細(xì)胞中神經(jīng)細(xì)胞的比例。大多數(shù)誘導(dǎo)后的MSCs表現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，NEU陽(yáng)性（44.7％±13.2％）和 TUJ-1 陽(yáng)性（52.7％±12.4％）。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Defeng Zou;Yi Chen;Yaxin Han;Chen Lv;Guanjun Tu;;Overexpression of microRNA-124 promotes the neuronal differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J];Neural Regeneration Research;2014年12期

2 Yuxin Ni;Kaizhi Zhang;Xuejuan Liu;Tingting Yang;Baixiang Wang;Li Fu;Lan A;Yanmin Zhou;;miR-21 promotes the differentiation of hair folliclederived neural crest stem cells into Schwann cells[J];Neural Regeneration Research;2014年08期

本文編號(hào)：2603593