慢病毒介導(dǎo)熱休克蛋白目的片段至人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)皮瓣缺血再灌注損傷

發(fā)布時間：2020-03-21 14:21

【摘要】：目的為提高皮瓣缺血再灌注損傷的治療效果,該實驗將熱休克蛋白90α(Hsp90α)功能片段與腺病毒相結(jié)合,通過病毒轉(zhuǎn)染的方式介入至人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(h UC-MSCs)內(nèi)。采用點狀注射的途徑應(yīng)用于大鼠皮瓣缺血再灌注損傷模型。觀察各個時間段皮瓣顏色、毛發(fā)生長、壞死面積等宏觀現(xiàn)象和HE染色、免疫組化等微觀現(xiàn)象�？傮w探討攜帶Hsp90α功能片段的h UC-MSCs對皮瓣缺血再灌注損傷的治療效果,為后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。方法在本次實驗中,我們選用三種質(zhì)粒(包括目的質(zhì)粒載體)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并在轉(zhuǎn)然后的一定時間內(nèi)提取尚未純化處理的細(xì)胞上清液,根據(jù)實驗需求濃縮純化細(xì)胞上清液,制備成所需滴度的腺病毒原液,超低溫冰箱保存。同時取樣檢測腺病毒的各項指標(biāo),以便用于實驗研究。其次,在含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代h UC-MSCs;在狀態(tài)良好的干細(xì)胞中加入制備好的腺病毒,培養(yǎng)一段時間后在電子顯微鏡下觀察并確定轉(zhuǎn)染的最佳MOI值。通過MTT和q PCR檢測腺病毒對h UC-MSCs的毒性及轉(zhuǎn)染后h UC-MSCs的增殖能力;細(xì)胞劃痕實驗檢測攜帶目基因的h UC-MSCs遷移效果。然后,選取96只成年大鼠,隨機(jī)分為攜帶“F-5”基因組;“空載病毒”組;未轉(zhuǎn)染組;未注射處理組。在無菌環(huán)境下制備大鼠腹部3×6cm島狀皮瓣,皮瓣深達(dá)深筋膜,鈍性分離皮瓣,找到腹壁動靜脈(股動靜脈分支),玻璃分針小心分離腹壁動靜脈與皮膚,最后完全離斷腹部皮膚,制備成只有腹部動靜脈供血的島狀皮瓣,用微型血管夾夾閉血管8小時。最后,取含有目的基因的h UC-MSCs、攜帶空載腺病毒的h UC-MSCs和正常h UCMSCs分組培養(yǎng),制備成濃度為4×105/ml的細(xì)胞懸液。待動物模型制備成功后,在腹部島狀皮瓣上選取10個注射點行皮下注射,每個注射點間隔1cm,每點注射量為0.1 ml。為降低實驗影響因素,設(shè)置注射等量生理鹽水組做為對照組。從各實驗組中隨機(jī)選取1天、3天、5天、7天大鼠,全身麻醉,使用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄皮瓣顏色、毛發(fā)生長情況,使用Image-Pro-plus軟件評估皮瓣成活面積;HE染色觀察皮膚組織層次和毛細(xì)血管密度變化;免疫組化(IHC)檢測動物皮瓣血管周邊CD31表達(dá)情況。結(jié)果注射攜帶“F-5”基因h UC-MSCs組的動物模型,腹部皮瓣顏色和毛發(fā)生長情況均優(yōu)于其它實驗組,皮瓣存活面積可達(dá)16.5cm2,較對照組有明顯提高。免疫組化結(jié)果顯示攜帶“F-5”基因組的皮瓣血管周邊CD31含量遠(yuǎn)高于空載病毒組、未轉(zhuǎn)染組和生理鹽水組。結(jié)論實驗采用“干細(xì)胞/基因”聯(lián)合治療的新方法。通過組織工程技術(shù)成功將Hsp90α中的“F-5”基因片段轉(zhuǎn)染入h UC-MSCs,并用于改善大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷。通過細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)方面的檢測驗證出攜帶“F-5”基因片段的h UCMSCs能有效改善皮瓣缺血再灌注損傷。
【圖文】：

示意圖,腺病毒,轉(zhuǎn)染,示意圖

1.2.4 MTT 細(xì)胞學(xué)檢測選用傳代后 3 天的 hUC-MSCs 制備成含 10％胎小牛血清的單個細(xì)胞懸液，以每孔 1000 個細(xì)胞接種到 96 孔板，，每孔體積 200ul，每孔加 MTT 溶液 10ul（MTT 濃度為 5mg/ml）。繼續(xù)孵育 4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔 100ulDMSO，振蕩 10min，使結(jié)晶物充分融解。之后選擇 490nm 波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光密度值（OD），記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線藥物。步驟如下：1.2.4.1 細(xì)胞分組將細(xì)胞分為三組：正常細(xì)胞組；空載轉(zhuǎn)染組；目的基因轉(zhuǎn)染組。1.2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于含青霉素、鏈霉素（各 1 U/mL，0.1mg/mL）10%FBS 的 DMEM 低糖培養(yǎng)基中，放置在 37℃、5％CO2、相對濕度為 100%的細(xì)胞培養(yǎng)箱

病毒,細(xì)胞密度,顯微鏡