【摘要】：研究背景:1953年,皮質(zhì)類固醇藥物引起股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)的現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)。目前,長期或大量使用激素已成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首要發(fā)病因素。激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)是由于應(yīng)用激素類藥物,導(dǎo)致股骨頭血液供應(yīng)受損,多種骨基質(zhì)細(xì)胞死亡,進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭承重區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)改變,股骨頭不可逆性塌陷,最終導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)功能障礙的代謝性疾病。最終,大多數(shù)患者不得不進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)治療,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,并給社會帶來了巨大負(fù)擔(dān)。多年來,對SONFH發(fā)病機(jī)制的探究不斷深入,眾多學(xué)說被提出,其中包括脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說、骨髓間充質(zhì)的細(xì)胞成骨能力減弱學(xué)說、炎癥與細(xì)胞凋亡學(xué)說、血液供應(yīng)不足學(xué)說、基因多態(tài)性等等。然而,SONFH的確切病理過程尚不完全清楚,仍需要進(jìn)一步深入研究。因此,探究SONFH的發(fā)病機(jī)制,對疾病的預(yù)防、早期診斷、治療存在重要意義。最新研究發(fā)現(xiàn),SONFH患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)增殖能力下降,且成骨分化能力減弱、成脂分化能力增強(qiáng)。BMSC是骨髓中一種多能干細(xì)胞,可分化為多種骨基質(zhì)細(xì)胞,并且在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要病理生理作用。既往研究發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能紊亂與多種代謝性骨病的發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān),如骨質(zhì)疏松癥、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨肉瘤等。BMSC在代謝性骨病中調(diào)控作用成為近年來的研究熱點。micro RNA(miRNA)是一種長度為18-24 nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子,在動植物中參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因m RNA 3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,通過抑制其翻譯和/或促進(jìn)其降解的方式抑制靶基因表達(dá)。部分miRNA已被證明參與調(diào)控BMSC的增殖和多向分化過程,并發(fā)揮重要作用。目前,激素刺激導(dǎo)致BMSC miRNA表達(dá)譜變化尚不明確,探究SONFH患者BMSC miRNA表達(dá)譜變化對SONFH的早期診斷和治療具有重要意義。本實驗應(yīng)用miRNA基因芯片篩選SONFH患者與股骨頸骨折(femoral neck fracture,FNF)患者BMSC差異表達(dá)的miRNA,通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miRNA調(diào)控的靶基因和信號通路,并檢測miRNA在BMSC成骨/成脂分化過程中的變化趨勢,明確miRNA與BMSC成骨/成脂分化的相關(guān)性,為明確激素性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。研究方法:1、BMSC分離、培養(yǎng)和鑒定:從3例股骨頸骨折和3例激素性股骨頭壞死行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者股骨近端髓腔內(nèi)抽取骨髓,用密度梯度離心法,分離獲得BMSC進(jìn)行體外培養(yǎng),并對細(xì)胞表型、成骨/成脂能力進(jìn)行初步鑒定。2、miRNA基因芯片篩選差異表達(dá)表達(dá)miRNA:對三代股骨頸骨折BMSC和激素性股骨頭壞死BMSC提取總RNA,應(yīng)用miRNA基因芯片檢測miRNA表達(dá)情況,篩選得到差異表達(dá)的miRNA,并通過q RT-PCR驗證miRNA表達(dá)差異。3、差異表達(dá)的miRNA生物信息學(xué)分析:對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測、GO分析和KEGG分析,預(yù)測miRNA參與調(diào)控的細(xì)胞進(jìn)程和信號通路。4、BMSC成骨/成脂分化過程中miRNA表達(dá)變化趨勢檢測:體外誘導(dǎo)BMSC成骨、成脂分化,以誘導(dǎo)周期為時間點提取BMSC總RNA。利用q RT-PCR檢測BMSC成骨、成脂分化過程中miRNA表達(dá)變化趨勢,明確差異表達(dá)的miRNA與BMSC成骨、成脂分化的相關(guān)性。結(jié)果:1、成功分離、體外培養(yǎng)獲得BMSC,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對其表面標(biāo)志物進(jìn)行了鑒定,CD29+(98.86%)、CD90+(96.42%)、CD34-(9.12%),并通過誘導(dǎo)成骨/成脂分化和相關(guān)染色確定了其潛在的成骨/成脂分化能力。2、經(jīng)miRNA基因芯片檢測,miR-4298、miR-4425、miR-601、miR-452-3p、miR-582-5p、miR-647、miR-5006-3p、miR-516b-5p、miR-668-3p、miR-513b-5p、miR-3687、miR-181a-3p、miR-1246、miR-4436b-3p、miR-3976、miR-4530、miR-4421等17個miRNA表達(dá)上調(diào),miR-127-5p、miR-887-3p、miR-519e-3p、miR-933、miR-122-3p等5個miRNA表達(dá)下調(diào)。3、經(jīng)q RT-PCR驗證,miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-122-3p在激素性股骨頭壞死和股骨頸骨折BMSC中表達(dá)量存在顯著性差異,且與miRNA基因芯片檢測結(jié)果一致。4、miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p在BMSC成骨分化過程中表達(dá)量呈下降趨勢,在成脂分化過程中表達(dá)量逐漸升高,而miR-122-3p在BMSC成骨分化過程中表達(dá)量逐漸升高,在成脂分化過程中表達(dá)逐漸降低。5、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p、miR-122-3p的靶基因主要富集在泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路(ubiquitin mediated proteolysis)、腫瘤膽堿代謝(choline metabolism in cancer)、糖酵解與糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)等信號通路。結(jié)論:1、篩選出激素性股骨頭壞死BMSC特異性miRNA表達(dá)譜變化。2、miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p、miR-122-3p可能通過泛素介導(dǎo)的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、腫瘤膽堿代謝(choline metabolism in cancer)、糖酵解與糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)等信號通路調(diào)節(jié)BMSC增殖、分化和凋亡等過程。3、miR-601、miR-452-3p、miR-647、miR-516b-5p、miR-127-5p可能為BMSC成骨分化負(fù)性調(diào)節(jié)因子,抑制成骨分化、促進(jìn)成脂分化;miR-122-3p可能為BMSC成骨分化正向調(diào)節(jié)因子,促進(jìn)成骨分化、抑制成脂分化。
【圖文】：

激素性股骨頭壞死的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制

第 2 章 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定編號 性別 年齡 診斷 基礎(chǔ)疾病 激素應(yīng)用時長B3 女 60 右股骨頭壞死 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 1.5 年B4 男 69 右股骨頭壞死 哮喘 1 年B5 男 55 左股骨頭壞死 間質(zhì)性肺病 1 年B6 女 68 右股骨頭壞死 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 1.5 年B7 女 68 雙側(cè)股骨頭壞死 哮喘 4 年B8 女 56 右股骨頭壞死 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 2 年B9 男 61 右股骨頭壞死 間質(zhì)性肺病 2 年
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R681.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2590452