【摘要】：背景骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤,好發(fā)于青少年和兒童,惡性程度高且較早發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者的身心健康。雖然經(jīng)過新輔助化療、外科手術(shù)、放療等綜合治療,患者的5年生存率提高至60%-80%,但臨床上仍有較多患者存在局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),預(yù)后差。骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者存活率的重要因素,但目前關(guān)于骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確,因此有必要探究骨肉瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制,進(jìn)一步提高患者的存活率。miRNA(microRNAs)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),參與多種腫瘤的生長、分化、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡,miRNA與骨肉瘤的相關(guān)性研究較少。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-100在多種惡性腫瘤中表現(xiàn)為低表達(dá),并抑制惡性腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)miR-100在骨肉瘤細(xì)胞株中低表達(dá),需進(jìn)一步明確miR-100對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。目的明確miR-100在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,研究過表達(dá)miR-100對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響,為骨肉瘤的基因靶向治療提供理論依據(jù)和新手段。方法1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-100在骨肉瘤細(xì)胞株HOS、U-2OS、Saos-2、MG-63和正常成骨細(xì)胞NHOst中的表達(dá)水平。2.在骨肉瘤細(xì)胞株MG-63中采用脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染miR-100 mimics、miR-100 NC,構(gòu)建骨肉瘤細(xì)胞干預(yù)模型,設(shè)為miR-100組(轉(zhuǎn)染miR-100 mimics)、miR-100 NC組(轉(zhuǎn)染miR-100 NC)、control組(只加入脂質(zhì)體2000);實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-100在miR-100組、miR-100NC組和control組中的表達(dá)水平,驗(yàn)證miR-100的轉(zhuǎn)染效率。3.分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h、96h后取細(xì)胞進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn),酶標(biāo)儀測定波長在450nm的吸光度,比較不同時(shí)間點(diǎn)miR-100組、miR-100 NC組和control組之間細(xì)胞增殖能力。4.構(gòu)建細(xì)胞模型成功后,在含有matrigel的小室中行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn),光鏡下進(jìn)行視野計(jì)數(shù),比較miR-100組、miR-100 NC組和control組之間細(xì)胞侵襲能力的變化。5.構(gòu)建細(xì)胞模型成功后,在不含matrigel的小室中行Transwell遷移實(shí)驗(yàn),光鏡下進(jìn)行視野計(jì)數(shù),比較miR-100組、miR-100 NC組和control組之間細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果1.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-100在骨肉瘤細(xì)胞株HOS(P=0.004)、U-2OS(P=0.000)、Saos-2(P=0.017)、MG-63(P=0.000)中表達(dá)水平均顯著低于正常成骨細(xì)胞NHOst,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明與NHOst相比miR-100在骨肉瘤細(xì)胞株中低表達(dá)。2.骨肉瘤細(xì)胞株MG-63轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明miR-100組表達(dá)量明顯高于miR-100 NC組和control組,miR-100組與miR-100 NC組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),miR-100組與control組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),miR-100 NC組和control組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.992),表明miR-100轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞模型構(gòu)建成功。3.CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染0h時(shí)間點(diǎn)后miR-100組、miR-100 NC組和control組之間CCK-8 OD_(450nm)值大致相近,三組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.439);在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h時(shí)間點(diǎn)后miR-100組CCK-8 OD_(450nm)值均低于miR-100 NC組及control組,miR-100組和miR-100NC組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),miR-100組和control組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),miR-100 NC組和control組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與miR-100NC組、control組相比miR-100組增殖曲線圖明顯下移,表明過表達(dá)miR-100抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-100組通透基底膜細(xì)胞數(shù)量明顯低于miR-100 NC組、control組,miR-100組和miR-100 NC組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),miR-100組和control組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000);miR-100 NC組和control組細(xì)胞數(shù)量大致相近,兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.904);提示過表達(dá)miR-100抑制了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。5.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-100組進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量明顯低于miR-100 NC組、control組,miR-100組和miR-100 NC組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000),miR-100組和control組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000);miR-100 NC組和control組細(xì)胞數(shù)量大致相同,兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.880);提示過表達(dá)miR-100抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論1.與正常成骨細(xì)胞NHOst相比miR-100在骨肉瘤細(xì)胞株中低表達(dá)。2.在骨肉瘤細(xì)胞株中過表達(dá)miR-100可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。3.miR-100可以成為骨肉瘤治療的靶向基因,為骨肉瘤的治療帶來一種新的方法。
【圖文】：

3.1 四種骨肉瘤細(xì)胞株中 miR-100 和內(nèi)參反應(yīng)曲線骨肉瘤細(xì)胞株HOS、U-2OS、Saos-2、MG-63中miR-100和內(nèi)參引物溶解曲線分別如圖3-1、3-2所示，miR-100和內(nèi)參引物擴(kuò)增曲線分別如圖3-3、3-4所示。觀察各細(xì)胞系引物溶解曲線圖可見miR-100和內(nèi)參U6均為單一尖銳峰，表明特異性良好，擴(kuò)增后未形成非特異性產(chǎn)物，擴(kuò)增效果較好。圖3-1 各細(xì)胞株中miR-100引物溶解曲線（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）圖3-2 各細(xì)胞株中U6引物溶解曲線（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）

成非特異性產(chǎn)物，擴(kuò)增效果較好。圖3-1 各細(xì)胞株中miR-100引物溶解曲線（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）圖3-2 各細(xì)胞株中U6引物溶解曲線（A.HOS B.U-2OS C.Saos-2 D.MG-63）
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 上官建偉;梁俊芳;肖新廣;張新明;劉玉珂;;骨肉瘤X線與CT和MRI影像特點(diǎn)及診斷價(jià)值[J];醫(yī)藥論壇雜志;2015年11期

2 凌東進(jìn);廖前德;施天生;;miR-100通過靶向IGF2調(diào)控非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2015年21期

3 黃飛;王顯勛;羅小江;;新輔助化療結(jié)合保肢手術(shù)治療骨肉瘤的臨床研究[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2015年13期

4 隋承光;孟凡東;付立業(yè);;MicroRNA-100調(diào)節(jié)mTOR表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2015年01期

5 管帥;徐文堅(jiān);;2013年WHO骨腫瘤新分類探討[J];臨床放射學(xué)雜志;2014年10期

6 于萬濤;王朝霞;;miR-100與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2014年08期

7 張紅鴿;范秉琳;嵇曉輝;蔡新華;朱武凌;;miRNA-100下調(diào)polo樣激酶1表達(dá)促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡[J];中國腫瘤生物治療雜志;2013年01期

8 楊勇昆;;骨肉瘤診斷、治療、隨訪的ESMO臨床指南[J];中國骨腫瘤骨病;2010年02期

9 高杰;楊彤濤;裘秀春;魚兵;韓建偉;范清宇;馬保安;;成骨肉瘤細(xì)胞SOSP-9607中miRNA的克隆與驗(yàn)證[J];癌癥;2007年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 羅展鵬;miR-548c-3p在骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用和分子機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 王威;骨肉瘤流行病學(xué)研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 雷雨;骨肉瘤的臨床治療進(jìn)展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

2 趙天達(dá);常見治療方式對(duì)四肢骨肉瘤患者生存時(shí)間及預(yù)后因素影響的回顧性研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2016年

3 李剛;microRNA-100對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖的影響及對(duì)VEGF和survivin蛋白的調(diào)節(jié)研究[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2015年

4 吳志峰;四肢骨肉瘤臨床治療研究及預(yù)后因素分析[D];吉林大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：2588955