【摘要】：背景急性腎損傷(AKI)是住院患者常見及嚴(yán)重的并發(fā)癥,增加了住院患者的死亡率。體外循環(huán)的心臟手術(shù)是僅次于膿毒癥之后導(dǎo)致AKI的第二類常見原因。心臟手術(shù)相關(guān)的急性腎損傷(CSA-AKI)的病理生理學(xué)是復(fù)雜的,有多個因素參與,其包括的損傷途徑有:缺血再灌注損傷,外源性和內(nèi)源性毒素,炎癥反應(yīng),氧化應(yīng)激和血流動力學(xué)因素。目前認(rèn)為體外循環(huán)(CPB)是心臟術(shù)后發(fā)生AKI的主要致病因素。心臟術(shù)前具有高危因素的患者,比如高齡,糖尿病,心衰以及需要長時間CPB的心臟手術(shù)都增加了術(shù)后AKI的發(fā)生風(fēng)險,大約增加了30%~40%。目前在臨床上,術(shù)前具有并發(fā)癥的患者以及需要復(fù)雜心臟外科治療的患者日益增多,那么,CSAAKI的發(fā)生率就會有進(jìn)一步增高的趨勢。所以,CSA-AKI是一個亟待需要闡明的臨床綜合征。CSA-AKI患者是理想的AKI研究人群,因為損害的時間已知。而目前CSA-AKI的發(fā)病機理還不明確,代表腎臟損傷的指標(biāo)也不能及時診斷AKI的發(fā)生。微小RNA(miRNA,miR),是一類非編碼小分子RNA,長度大概20到24個核苷酸,通過與靶向信使RNA(m RNA)的3'-非編碼區(qū)結(jié)合從而抑制靶向蛋白的翻譯,實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。近幾年miRNA在腎臟疾病領(lǐng)域的研究是一個熱點問題。目前對動物模型和一些類型AKI的研究,比如缺血再灌注損傷的AKI,腎移植術(shù)后的AKI,積累的證據(jù)表明,多種miRNA可能參與了AKI的發(fā)病機制,顯示了其潛在的臨床價值,提供了研究CSA-AKI分子機制的新思路;被分泌到循環(huán)或尿液中的miRNA可以作為具有高度敏感性和特異性的生物標(biāo)志物來研究CSA-AKI的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。目的篩查體外循環(huán)心臟外科術(shù)后患者的血清,分析在CSA-AKI與非CSA-AKI患者之間差異表達(dá)的miRNA,初步探討參與CSA-AKI發(fā)生過程的miRNA,并選取CSAAKI相關(guān)的miRNA進(jìn)行臨床驗證。方法通過miRNA芯片技術(shù)來篩查體外循環(huán)心臟外科術(shù)后患者的血清,篩查CSA-AKI患者與非CSA-AKI患者之間miRNA的表達(dá)差異。本研究通過醫(yī)院倫理委員會同意,并取得患者知情同意書。選擇在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟外科行體外循環(huán)停跳下瓣膜手術(shù)或者瓣膜手術(shù)同期行冠狀動脈旁路移植手術(shù)的成人患者,術(shù)前沒有慢性合并癥,術(shù)后沒有發(fā)生腎臟以外的器官損傷。CSA-AKI診斷根據(jù)2012年腎臟疾病改善全球預(yù)后(KDIGO)標(biāo)準(zhǔn),即患者的血清肌酐在心臟術(shù)后48小時內(nèi)上升大于0.3mg/dl(26.5mmol/L)或者在心臟術(shù)后7天內(nèi)血清肌酐較術(shù)前基礎(chǔ)值上升了1.5倍以上。所有患者行統(tǒng)一常規(guī)的術(shù)前檢查,術(shù)中麻醉及手術(shù)操作,術(shù)后重癥監(jiān)護及常規(guī)檢查。所有患者臨床無特殊情況的用藥。采集患者術(shù)前(年齡、性別、體重、身高、紐約心功能分級),術(shù)中(體外循環(huán)時間,主動脈阻斷時間,手術(shù)時間),術(shù)后(機械通氣時間,ICU停留時間,住院時間)的臨床數(shù)據(jù)。在患者進(jìn)入監(jiān)護室24小時左右,抽取橈動脈血液5ml,靜置、離心、分裝后凍存于-80°?冰箱,避免反復(fù)凍融,收集完成后統(tǒng)一送樣進(jìn)行miRNA的芯片篩查。使用edge R軟件對分組間進(jìn)行miRNA的差異分析。差異miRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)量變化2倍以上并且P值小于0.05。通過miRNA芯片技術(shù)篩查出來CSA-AKI相關(guān)的miRNA,采用熒光定量PCR技術(shù),來進(jìn)一步的做臨床驗證。選取在患者進(jìn)入手術(shù)全身麻醉后、外科正中開胸前(1),手術(shù)完成入監(jiān)護室后1小時(2)、3小時(3)、6小時(4)、12小時(5)及24小時(6),在上述6個時間點抽取橈動脈血液5ml,靜置、離心、分裝后凍存于-80°冰箱,等待統(tǒng)一送樣進(jìn)行檢測。測定的指標(biāo)包括某種CSA-AKI相關(guān)的miRNA(Real-time PCR),血清腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)及中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂蛋白(NGAL)(酶聯(lián)免疫法),血清白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)(化學(xué)發(fā)光法)。結(jié)果miRNA芯片技術(shù)共篩查共了7位患者的血清,其中心臟術(shù)后非AKI組(NONAKI)3位患者,CSA-AKI組(AKI)為4位患者,術(shù)后的AKI都為一過性,出院時腎功能均已恢復(fù)至術(shù)前基礎(chǔ)值水平。兩組患者術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后臨床資料大致相同。分別經(jīng)過提取血清樣本的質(zhì)檢合格,小RNA文庫的質(zhì)檢合格,數(shù)據(jù)過濾的質(zhì)檢合格后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,CSA-AKI組和心臟術(shù)后的正常對照組比較共有38個miRNA的表達(dá)差異,其中表達(dá)上調(diào)的miRNA有24個,表達(dá)下調(diào)的miRNA有14個。選取CSA-AKI相關(guān)的hsa-miRNA-494-3p在AKI組(n=10)心臟術(shù)后1小時即上升達(dá)到峰值,在術(shù)后3小時和術(shù)后6小時仍與NON-AKI組(n=8)有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。AKI組的NGAL在術(shù)后3小時與NON-AKI組有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。血清IL-6在心臟術(shù)后24小時內(nèi)各個時間點上,以及術(shù)后48小時、72小時,兩組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。IL-10,MCP-1和TNF-a在心臟術(shù)后24時內(nèi)各個時間點上,兩組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平在心臟術(shù)后第一天、第二天、第三天持續(xù)上升,并且CRP水平在AKI組較NON-AKI組要高,但是,CRP水平在兩組間的各個時間點上也無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。白細(xì)胞計數(shù)(WBC)在兩組都表現(xiàn)為心臟術(shù)后持續(xù)升高,48小時左右達(dá)到高峰后下降,但是,在兩組間各個時間點上并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。中性粒細(xì)胞百分比(N(%))在兩組都表現(xiàn)為心臟術(shù)后持續(xù)升高,48小時左右達(dá)到高峰后緩慢下降,并且,N(%)在兩組間各個時間點上均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。白蛋白(ALB),總膽紅素(TBIL)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)在兩組間術(shù)后七天內(nèi)的各個時間點上均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論通過高通量miRNA的芯片檢測技術(shù),篩查了在CSA-AKI患者與非CSA-AKI患者之間差異表達(dá)的miRNA,共有38個已知的人類miRNA,其中表達(dá)上調(diào)的miRNA基因有24個,表達(dá)下調(diào)的miRNA基因有14個,miRNA的差異表達(dá)可能揭示了CSA-AKI的發(fā)病機制。在篩查的38個CSA-AKI相關(guān)的miRNA中,驗證了hsa-miR-494-3p可以作為CSA-AKI患者早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)記物,hsa-miR-494-3p可能參與了CSA-AKI發(fā)生過程的早期階段,并且也可能預(yù)示了CSA-AKI的預(yù)后。
【圖文】：

圖 1-1 實驗流程圖Fig1-1 Flow chart信息分析息分析部分主要分成三個模塊：首先，對每個樣品的原始測序數(shù) RNA 的 tag 序列；其次，對 tag 進(jìn)行注釋，鑒定樣品中的小 R，鑒定 miRNA；最后，得到 miRNA 表達(dá)譜，對 miRNA 基因差異分以及靶基因的富集分析。信息分析流程見圖 1-2 所示。數(shù)據(jù)處理

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文術(shù)期的變化見圖 2-3。心臟術(shù)后第 1 小時 AKI 組的血清 miRNA-494-3p 值是 33.10±35.73，NON-AKI 組是 3.37±4.32，兩組間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.0068）；術(shù)后 3 小時 AKI 組的血清 miRNA-494-3p 值是 22.11±32.26，NON-AKI 組是 2.40±2.67，兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.0136）；術(shù)后 6 小時的血清 miRNA-494-3p 值在AKI 組是 15.29 ± 12.66 ，， NON-AKI 組是 2,89 ± 2.17 ，兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.0155）。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R654.2;R692.5

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本文編號：2588424