【摘要】：[目的]：1.探討攜帶增強綠色熒光蛋白(EGFP)的慢病毒載體感染人脂肪間充質干細胞(hADSCs)的最佳條件及其對hADSCs成脂分化能力的影響；2.hADSCs與人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)建立共培養(yǎng)體系,與絲素蛋白支架聯(lián)合構建組織工程脂肪的可行性；3.慢病毒介導VEGF165感染hADSCs與HUVEC共培養(yǎng)構建的脂肪組織工程修復大鼠后肢軟組織缺損。[方法]：1.從人體正常脂肪組織中提取出脂肪問充質干細胞,體外培養(yǎng)并擴增；行成脂及成骨誘導鑒定脂肪間充質干細胞的多向分化特性,流式細胞儀檢測細胞表面分子CD3、CD44、CD45、CD90;在不同的感染復數(MOI)條件下,對hADSCs感染8小時后觀察感染效果；流式細胞儀檢測感染效率；MTT法檢測感染對hADSCs的增殖能力的影響；對感染后的hADSCs 成脂誘導 14d,行油紅0染色后,應用Image-Pro Plus圖像分析軟件比較hADSCs的成脂能力；2.HUVEC的擴增與表面分子CD31、CD34的測定；hADSCs與HUVEC增殖曲線的測定,觀察兩種細胞按照不同比例共培養(yǎng)時生長情況；將共培養(yǎng)細胞種植于絲素蛋白支架后行電鏡掃描觀察細胞在支架上的形態(tài)；成脂誘導14天后,油紅O染色及RT-PCR鑒定共培養(yǎng)組與單純hADSCs組成脂情況。3.體內實驗：選取Wistar大鼠18只,制成后肢軟組織缺損模型。實驗設計分為三組,Ⅰ組：經VEGF165基因轉染的hADSCs與HUVEC構成的共培養(yǎng)體系,Ⅱ組：單純經VEGF165基因轉染的hADSCs,Ⅲ組：為空白對照。分別將兩組細胞與多孔絲素蛋白支架聯(lián)合后,種植于大鼠模型的軟組織缺損處,于4w及8w取材,觀察構建物在體內的生長情況,并比較濕重,電鏡下觀察細胞的生長情況；行HE染色觀察構建的工程脂肪成脂及血管化情況,油紅O染色觀察成脂情況。[結果]：1.脂肪組織中成功分離出脂肪間充質干細胞,流式細胞儀檢測CD44及CD90陽性,CD34及CD45陰性,多向分化能力。以MOI值1、10、25、50、75、100、150攜帶EGFP的慢病毒感染hADSCs時,其感染效率依次為0.24%、13.48%、40.33%、89.27%、94.52%、98.49%和99.11%。以MOI值50感染iADSCs,比較感染前后細胞的增殖與成脂能力,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；2.流式細胞儀測定HUVEC表面分子CD31 (+), CD34馬陽性；MTT結果顯示HUVEC增殖速度快于1ADSCs,以 HUVEC:hADSCs為1：4比例共同培養(yǎng)3天后,細胞融合時兩者比例約為1：1；將共培養(yǎng)細胞接種于絲素蛋白支架,成脂誘導14天后,通過RT-PCR可成功測定出PPARγ2基因的表達,油紅O染色表明成脂誘導后,兩組均能誘導出大量的脂肪細胞；3.飼養(yǎng)4w及8w后,大體標本結果顯示均能修補軟組織缺損,比較兩組構建物的濕重：VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培養(yǎng)組 VEGF165-hADSCs組,冰凍切片后行油紅O染色均可見紅染的脂滴,電鏡下共培養(yǎng)細胞狀態(tài)明顯優(yōu)于較單純hADSCs組；HE染色兩組均有不同程度的血管化,但VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培養(yǎng)組血管數目明顯多于單純VEGF165-hADSCs組。[結論]：1.慢病毒感染ADSCs的最佳MOI值為50,感染后對hADSCs增殖,成脂能力無明顯影響；2. hADSCs可與HUVEC共同培養(yǎng),以1：4比例構成共培養(yǎng)組與絲素蛋白聯(lián)合,可在絲素蛋白支架上成功構建出工程脂肪。3.以慢病毒介導VEGF165感染的hADSCs與HUVEC共培養(yǎng)體系為種子細胞,有孔絲素蛋白為支架材料,所構建的組織工程脂肪可有效修復大鼠軟組織缺損。
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R622

【參考文獻】

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1 劉毅;李世龍;惠玲;;轉染攜帶人胰島素基因慢病毒載體提高顆粒脂肪移植物存活率的實驗研究[J];蘭州大學學報(醫(yī)學版);2014年01期

2 鄭宣;許世超;全仁夫;;慢病毒載體介導VEGF_(165)基因修飾大鼠毛囊干細胞的實驗研究[J];中國修復重建外科雜志;2014年02期

3 王和庚;黎洪棉;崔世恩;徐昆明;;帶血管肌筋膜包埋脂肪干細胞載體復合物構建血管化組織工程脂肪(英文)[J];中國組織工程研究;2013年18期

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本文編號：2576656