【摘要】：研究背景先天性心臟病(先心病)是目前我國(guó)最常見(jiàn)的出生缺陷,嚴(yán)重影響我國(guó)的人口質(zhì)量,增加家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。隨著先心病的診療水平不斷提高,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已將先心病的防治延伸到胎兒期,但是未能突破胎兒體外循環(huán)的技術(shù)障礙,包括良好的胎兒心肌保護(hù),阻礙了胎兒心臟外科的發(fā)展。胎兒心肌細(xì)胞處于宮內(nèi)低氧環(huán)境,與生后心肌保護(hù)可能存在差異。因此,低氧條件下的胎兒心肌保護(hù)機(jī)制是胎兒心臟外科發(fā)展中需要解決的重要環(huán)節(jié)。目的探討低氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)對(duì)胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca~(2+))轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,為胎兒心肌保護(hù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法取胎齡14～18 d SD(Sprague-Dawley)大鼠胎鼠的心肌細(xì)胞置于含5%CO2,3%O2和92%N2的三氣培養(yǎng)箱,在37℃下培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分6組進(jìn)行干預(yù):對(duì)照組(1組),磷酸肌酸鈉10 μM(2組),HIF-1激動(dòng)劑(DMOG)100 μM(3 組),磷酸肌酸鈉 10 μM+DMOG 100 μM(4 組),HIF-1 抑制劑(Acriflavine)10μM(5組),磷酸肌酸鈉10μM+Acriflavine 10μM(6組),共同作用24 h后,分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR)和免疫印跡分析(Western-blot)檢測(cè)胎鼠心肌細(xì)胞HIF-1α、L型鈣離子通道(L-type calcium channel,LCa)、T 型鈣離子通道(T-type calcium channel,TCa)、鈉鈣交換蛋白(Na+/Ca~(2+) exchanger,NCX)、蘭尼堿(Ryanodine)受體和肌質(zhì)網(wǎng) Ca~(2+)-ATP 酶(Sarco/endoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPase 2a,SERCA2a)mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平。在激光共聚焦顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca~(2+))濃度的變化。結(jié)果Real-time PCR結(jié)果顯示:藥物干預(yù)和磷酸肌酸鈉在HIF-1α、TCa、NCX、Rynaodine受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有交互作用,磷酸肌酸鈉抑制藥物干預(yù)的作用。沒(méi)有磷酸肌酸鈉作用的組間比較:3組的HIF-1α、TCa、和NCX、Rynaodine受體的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于5組(P0.05,n=5)。磷酸肌酸鈉作用的組間比較:4組的HIF-1α、TCa、和NCX、Rynaodine受體的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于6組(P0.05,n=5)。藥物干預(yù)和磷酸肌酸鈉在LCa和SERCA2a的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上無(wú)交互作用,但SERCA2a的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在5組、6組顯著大于1組、2組、3組和4組(P0.05,n=5)。Westernblot結(jié)果顯示:藥物干預(yù)和磷酸肌酸鈉在各基因的蛋白表達(dá)上無(wú)交互作用,1組、2組的LCa的蛋白表達(dá)較3組、4組、5組和6組顯著升高(P0.05,n=5),SERCA2a的蛋白表達(dá)2組3組(P0.05)。鈣瞬變熒光量測(cè)定結(jié)果顯示藥物干預(yù)和磷酸肌酸鈉有交互作用,磷酸肌酸鈉抑制藥物干預(yù)產(chǎn)生的鈣瞬變(P0.05,n=10)。結(jié)論低氧條件下HIF-1參與胎鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。過(guò)度激活HIF-1 增強(qiáng) TCa、NCX 和 Rynaodine 受體 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平,降低 SERCA2a mRNA轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)下調(diào)LCa的蛋白表達(dá),從而增加細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)超載。給予磷酸肌酸鈉,抑制了 HIF-1及其調(diào)節(jié)的Ca~(2+)通路蛋白的mRNA水平,從而減輕細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)超載。由此推斷,抑制HIF-1活性、給予能量底物可能對(duì)胎兒心肌有保護(hù)作用。
【圖文】：

圖３－１邋ＲＮＡ電泳條帶圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｂａｎｄｉｎｇ邋４）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)逡逑①�。矗酰戾澹遥危聊０遄瞿孓D(zhuǎn)錄反表３－２Ｔａｂｌｅ３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｖｅｒｓｅ邐ＲＮａｓｅ邋Ｆｒｅｅ邋ｄｄＨ２0５邋ｘ邋ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？邋Ｂｕｆｆｅｒ（ｆｏｒ邋ｒｅａｌ邐ｔｉｍＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？邋ＲＴ邋Ｅｎｚｙｍｅ邋Ｍｉｘ邐ＩＯｌｉｇｏ邋ｄＴ邋Ｐｒｉｍｅｒ（５０邋｜ｉＭ）Ｒａｎｄｏｍ邋６邋ｍｅｒｓ（１００邋｜ｉＭ）ＲＮＡ總體積②反應(yīng)條件：３７°Ｃ邋６０ｍｉｎ，然

在含５％邋Ｃ0２，邋３％邋0２和９２％邋Ｎ２混合氣體的低氧培養(yǎng)箱內(nèi)３７°Ｃ培養(yǎng)２４邋ｈ逡逑后，于４０倍顯微鏡下可見(jiàn)心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，初為圓形，后變?yōu)樗笮�，單個(gè)細(xì)逡逑胞開(kāi)始搏動(dòng)。細(xì)胞逐漸在培養(yǎng)板鋪展，伸出偽足，相互接觸交織成網(wǎng)（見(jiàn)圖４－１）。逡逑ｆ邐％邐？逡逑．邐：，逡逑ｋＶ邐／邐．？邐－逡逑．逡逑？‘逡逑圖４－１心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)（４0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４－１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ（４0ｘ）逡逑４．２與藥物共同作用后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況逡逑分組加入藥物后培養(yǎng)２４ｈ，４０倍顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。在ＤＭＯＧ作逡逑用下，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，收縮有力；Ａｃｒｉｆｌａｖｉｎｅ作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且收縮逡逑減弱；增加底物磷酸肌酸鈉，細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，收縮較無(wú)增加底物有力（見(jiàn)圖４－２）。逡逑＇邋；５邋＾邋；＊逡逑？邋一邋Ｈ邋ｒ」逡逑＼邋＊邋％邋４邋？？邋，邋？？邋＼邋？逡逑＾邐？邐＞邋ｊｍ邐一逡逑空白對(duì)照組（１組）邐磷酸肌酸鈉１０邋ｇＭ邋（２組）逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R654.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 管倩楠;段斐;吳銀玲;王玉娟;張雪嬌;;用于鈣信號(hào)研究的小鼠心室肌細(xì)胞急性分離的優(yōu)化[J];醫(yī)學(xué)研究與教育;2016年02期

2 梁賅;杜偉;李爽;柯慶華;蔡君;楊繼元;;抑制HIF1α表達(dá)對(duì)低氧培養(yǎng)SGC-7901胃癌細(xì)胞CD44表達(dá)的影響[J];實(shí)用癌癥雜志;2015年09期

3 張賀;劉林華;石明;劉小山;唐煥文;;缺氧微環(huán)境下鈣信號(hào)介導(dǎo)鞘氨醇激酶1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2015年07期

4 張珂;賀晶;;胎兒心肌電生理的發(fā)育[J];中國(guó)計(jì)劃生育和婦產(chǎn)科;2014年05期

5 李銳;黨群;;病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制與治療研究進(jìn)展[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2011年10期

6 王永亮;沈亞峰;劉關(guān)省;胡淑婷;湯瑩;楊勇驥;;CGP37157對(duì)靜息期心肌細(xì)胞鈣循環(huán)的影響[J];電子顯微學(xué)報(bào);2011年03期

7 劉關(guān)省;沈亞峰;王永亮;胡淑婷;湯瑩;楊勇驥;;PKA信號(hào)通路與ryanodine受體介導(dǎo)的心肌肌漿網(wǎng)鈣泄漏關(guān)系的研究[J];電子顯微學(xué)報(bào);2009年06期

8 畢生輝;金振曉;王喜明;周京軍;彭道榮;魏旭峰;段維勛;易定華;;反向鈉鈣交換體在大鼠心臟鈣預(yù)處理中的作用[J];中國(guó)體外循環(huán)雜志;2008年01期

9 周成斌;張鏡芳;莊建;溫樹(shù)生;劉彥英;章曉華;;胎羊心臟轉(zhuǎn)流對(duì)胎羊心功能的影響[J];中華胸心血管外科雜志;2007年05期

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 ;磷酸肌酸鈉發(fā)展提速[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

，

本文編號(hào)：2563453