【摘要】：術后認知功能障礙(POCD)是老年患者術后常見并發(fā)癥,表現為學習、記憶等認知功能下降,增加并發(fā)癥和死亡率。目前研究認為,POCD的發(fā)病機制主要為中樞神經炎癥、氧化應激、膽堿能系統(tǒng)失調、β淀粉樣蛋白沉積等因素引起的神經元凋亡增加、再生減少、突觸可塑性下降等神經退行性改變。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA,通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結合發(fā)揮轉錄后調控作用,在中樞神經系統(tǒng)中含量豐富,對神經元發(fā)育、分化,突觸聯系和樹突棘形成等有重要調節(jié)作用。研究發(fā)現,高齡、應激、炎癥反應、缺血再灌注損傷等傷害性刺激可導致miRNA表達異常,且miRNA通過調節(jié)神經元突觸可塑性參與阿茨海默病(AD)、精神分裂癥、抑郁癥等認知障礙性疾病的發(fā)病過程�；谏鲜霭l(fā)現,我們推測,術后學習記憶等認知損害的發(fā)病機制之一可能是海馬中miRNA異常表達導致突觸可塑性下降。故本研究擬通過相關的實驗設計探討老齡小鼠海馬中miRNA的異常表達與其術后認知功能損害的相關性。第一部分不同麻醉手術方式對老齡小鼠術后認知功能的影響及海馬突觸可塑性情況的觀察目的:探討異氟醚吸入麻醉和腹部手術對老齡小鼠術后認知功能的影響,以及術后海馬神經元突觸可塑性變化情況。方法:實驗一:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、64只)按體重排序,隨機分為4組:對照組(con)、異氟醚組(iso)、手術組(sur)、異氟醚+手術組(iso+sur),每組16只,分別施以假手術、1.8%異氟醚吸入1.5h、局麻腹部手術、1.8%異氟醚吸入1.5h+局麻腹部手術處理,并于術前行曠場實驗、術后行Morris水迷宮實驗和條件恐懼實驗評價各組小鼠學習記憶功能。實驗二:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、48只)隨機分為4組,每組12只,分組和處理因素同實驗一,于術后第3、7天處死各組小鼠取腦組織,行免疫熒光染色觀察海馬組織突觸體素-1(SYN-1)表達情況,行蛋白印記實驗檢測突觸后致密95(PSD95)的相對表達量。結果:實驗一:曠場實驗中,各組小鼠跨越方格數和后腳站立次數相比均無明顯差異(P0.05)。Morris水迷宮實驗中,與對照組相比,手術組小鼠術后水迷宮登臺潛伏期延長(P0.05),目標象限停留時間縮短(P0.01)、穿臺次數減少(P0.05);而與手術組相比,異氟醚組和異氟醚+手術組登臺潛伏期縮短(P0.05),目標象限停留時間增加(P0.05)。條件恐懼實驗中,與對照組相比,手術組小鼠術后第1、3、7天場景測試凝滯時間百分比降低(P0.05),術后第3天聲音測試凝滯時間百分比降低(P0.05);與手術組相比,異氟醚組術后第3天場景測試凝滯時間百分比和聲音測試凝滯時間百分比均增加(P0.05),異氟醚+手術組術后第3、7天場景測試凝滯時間百分比增加(P0.05)。實驗二:免疫熒光染色發(fā)現,與其他各組相比,術后第3天手術組小鼠海馬組織SYN-1表達下降,突觸密度減少(P0.05),術后第7天各組相比無顯著差異(P0.05)。蛋白印記實驗發(fā)現,與對照組相比,手術組小鼠海馬組織PSD95術后第3天表達量降低(P0.05),與手術組相比,異氟醚組小鼠海馬PSD95術后第3天表達量增加(P0.05);各組小鼠海馬PSD95術后第7天表達量無顯著差異(P0.05)。結論:腹部手術可致老年小鼠術后早期空間學習記憶能力和關聯學習記憶能力發(fā)生損害,海馬神經元突觸可塑性下降,而異氟醚吸入麻醉可部分逆轉腹部手術造成的認知損傷和突觸可塑性下降,具有保護作用,進一步證實POCD的發(fā)病機制之一是突觸可塑性下降所致。第二部分術后認知功能障礙老齡小鼠海馬組織microRNA表達差異分析與初步驗證目的:比較和分析術后認知功能障礙老齡小鼠海馬組織microRNA表達變化情況,并初步探索其影響認知功能的可能機制。方法:實驗一:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、28只)按體重排序,隨機分為2組:對照組(con)和手術組(sur),每組14只,分別施以假手術和局麻腹部手術。術后24h每組隨機抽取3只小鼠處死取海馬組織,抽提總RNA,行miRNA microarray基因芯片檢測兩組小鼠海馬miRNA表達情況;每組隨機抽取3只小鼠處死,抽提海馬總RNA,液氮保存以備qRT-PCR驗證實驗;每組剩余8只小鼠行Morris水迷宮實驗評價認知功能。實驗二:對實驗一 miRNA microarray基因芯片中篩選出的miRNA(表達變化1.5倍以上)利用miRanda,miRDB,miRWalk等數據庫進行靶基因預測,并行GO分析及KEGG通路預測;對基因芯片篩選出的miRNA隨機抽取若干(miR-16-3p, miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p, miR-183-5p)行qRT-PCR驗證芯片結果。實驗三:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、36只)按體重排序,隨機分為4組:對照組(con)、異氟醚組(iso)、手術組(sur)、異氟醚+手術組(iso+sur),每組9只,分別施以假手術、1.8%異氟醚吸入1.5h、局麻腹部手術、1.8%異氟醚吸入1.5h+局麻腹部手術處理,于術后第1、3、7天每組隨機處死3只小鼠取海馬組織,對與認知功能相關的 miRNA(miR-155-5p,miR-582-5p, miR-134-5p)行 qRT-PCR檢測,對上述miRNA預測的靶蛋白環(huán)腺苷酸應答元件結合蛋白(CREB),腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)行Western Blot檢測。結果:實驗一: miRNA microarray基因芯片檢測發(fā)現,與對照組相比,腹部手術后24h,手術組小鼠海馬組織miRNA表達上調1.5倍以上的有29個,表達下調1.5倍以上的有34個。Morris水迷宮實驗發(fā)現,腹部手術造成老齡小鼠術后登臺潛伏期延長(P0.05),目標象限停留時間縮短(P0.01)、穿臺次數減少(P0.05),空間學習記憶能力下降。實驗二:通過對實驗一中篩選的表達改變1.5倍以上的miRNA進行靶基因預測發(fā)現,有36個miRNA與creb1(CREB基因)的表達有關,有23個miRNA與bdnf(BDNF基因)的表達有關。qRT-PCR實驗顯示,隨機抽取的miR-16-3p,miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p,miR-183-5p 的表達情況與基因芯片檢測的結果相比,差異無統(tǒng)計學意義。對篩選的miRNA行GO分析發(fā)現,涉及生物學途徑(BP)的GO Term有447個,涉及分子功能(MF)的GO Term有74個,細胞定位(CC)的有36個,多與炎癥、神經細胞發(fā)育分化、突觸形態(tài)和功能有關;行KEGG通路預測發(fā)現有多條與認知功能有關的信號通路被激活,如神經營養(yǎng)因子信號通路(Neurotrophin signaling pathway)、環(huán)腺苷酸信號通路(cAMP signaling pathway)、長時程增強(Long-term potentiation)、絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK signaling pathway)等。實驗三:選取與CREB和BDNF表達調控均有關的3個miRNA,即 miR-155-5p, miR-582-5p,miR-134-5p 行 qRT-PCR檢測發(fā)現,與其他各組相比,術后第1天,該3個miRNA在手術組小鼠海馬中表達明顯增高(P0.05),術后第3天miR-155-5p表達依然增高(P0.05),其余miRNA表達差異無統(tǒng)計學意義,術后第7天各組小鼠海馬組織miRNA表達基本無差別。WestemBlot實驗發(fā)現,與其他各組相比,術后第1、3天,手術組小鼠海馬組織CREB活性降低,第7天各組CREB活性差異無統(tǒng)計學意義;術后第3、7天,與其他各組相比,手術組小鼠海馬組織BDNF表達量減少。結論:腹部手術可致老齡小鼠術后認知功能發(fā)生損害,與術后早期海馬中miRNA表達譜改變有關。手術引起的創(chuàng)傷、中樞炎癥、氧化應激、缺血再灌注損傷等,使機體通過上調或下調miRNA的表達,對神經元的生長和凋亡、突觸的形態(tài)和功能、膠質細胞活化等多條信號通路進行調控,影響突觸可塑性,進而影響認知功能。其中,microRNA-CREB-BDNF通路可能是POCD發(fā)病機制之一。
【圖文】：

院動物倫理委員會許可。逡逑實驗用小鼠的排除標準是：１．小鼠頭、軀干、四肢形態(tài)異常者；２．活動明顯不協(xié)逡逑調者；３．毛發(fā)色澤欠佳或脫毛者。見圖１－１。逡逑擙逡逑圖１－１成年與老年Ｃ５７／ＢＬ６小鼠逡逑１７逡逑

逡逑圖１－２實驗一示意圖小鼠分４組（ｎ＝１６），，術前行曠場實驗（ＯＦｌ＞術后行Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮實驗逡逑（ＭＷＭ）和條件恐懼實驗（ＦＣＴ）邋ｃｏｎ：對照組；ｉｓｏ：異氟釀組；ｓｕｒ：手術組；ｉｓｏ＋ｓｕｒ：異氟酸＋手術組；逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ：行異氟越吸入處理；ｓｕｒｇｅｒｙ：行腹部手術處理逡逑實驗二：老齡Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（１８月齡、４８只）按體重編號，ＣＨＩＳＳ軟件隨機分為逡逑４組，每組１２只，分組和處理因素同實驗一。實驗流程如下（見圖１－３），行處理（ｄａｙＯ）逡逑后，于術后第３、７天隨機處死各組小鼠取腦組織，行免疫熒光染色觀察海馬組織突逡逑觸體素－ｌ（ＳＹＮ－ｌ）表達情況，行蛋白印記實驗檢測突觸后致密９５（ＰＳＤ９５）的相對表達逡逑量。逡逑邐邋ｊｎｏｎｅ逡逑ｃｏｎ（ｎ邋＝邋１２）邐１邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑邐邋ｄａｙ0邐（ｎ邋＝邋３）邐；邋邐（ｎ邋＝邋３）邐、逡逑邐邋ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ邐ｄａｙ３邐ｄａｙ７逡逑丨丨邋ｓ0＿）邐｜邐＾￣Ｑ＞邋—逡逑邐邋ｓｕｑｅｒｖ逡逑ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２）邐邐＾邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑邐Ｊ邐Ｌ邐邐ｄａｙＯ邐（ｎ邋＝邋３）邐）邐（ｎ邋＝邋３）逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ邐ｄａｙ邋３邐ｄａｙ邋７逡逑｜邋＿ｉｓｏ邋＋邋ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２ｊ＿Ｊ邐￣＾逡逑圖１－３實驗二示意圖小鼠分４組（ｎ＝１２）
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R614

【參考文獻】

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1 Yun-zhi LING;Wei MA;Li YU;Ye ZHANG;Qi-sheng LIANG;;七氟烷麻醉誘導的認知功能損傷與內測前額葉皮層中PSD95表達量降低有關（英文）[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年09期

本文編號：2560614