【摘要】：術(shù)后認知功能障礙(POCD)是老年患者術(shù)后常見并發(fā)癥,表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶等認知功能下降,增加并發(fā)癥和死亡率。目前研究認為,POCD的發(fā)病機制主要為中樞神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、膽堿能系統(tǒng)失調(diào)、β淀粉樣蛋白沉積等因素引起的神經(jīng)元凋亡增加、再生減少、突觸可塑性下降等神經(jīng)退行性改變。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA,通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,對神經(jīng)元發(fā)育、分化,突觸聯(lián)系和樹突棘形成等有重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),高齡、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等傷害性刺激可導(dǎo)致miRNA表達異常,且miRNA通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性參與阿茨海默病(AD)、精神分裂癥、抑郁癥等認知障礙性疾病的發(fā)病過程。基于上述發(fā)現(xiàn),我們推測,術(shù)后學(xué)習(xí)記憶等認知損害的發(fā)病機制之一可能是海馬中miRNA異常表達導(dǎo)致突觸可塑性下降。故本研究擬通過相關(guān)的實驗設(shè)計探討老齡小鼠海馬中miRNA的異常表達與其術(shù)后認知功能損害的相關(guān)性。第一部分不同麻醉手術(shù)方式對老齡小鼠術(shù)后認知功能的影響及海馬突觸可塑性情況的觀察目的:探討異氟醚吸入麻醉和腹部手術(shù)對老齡小鼠術(shù)后認知功能的影響,以及術(shù)后海馬神經(jīng)元突觸可塑性變化情況。方法:實驗一:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、64只)按體重排序,隨機分為4組:對照組(con)、異氟醚組(iso)、手術(shù)組(sur)、異氟醚+手術(shù)組(iso+sur),每組16只,分別施以假手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h、局麻腹部手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h+局麻腹部手術(shù)處理,并于術(shù)前行曠場實驗、術(shù)后行Morris水迷宮實驗和條件恐懼實驗評價各組小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。實驗二:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、48只)隨機分為4組,每組12只,分組和處理因素同實驗一,于術(shù)后第3、7天處死各組小鼠取腦組織,行免疫熒光染色觀察海馬組織突觸體素-1(SYN-1)表達情況,行蛋白印記實驗檢測突觸后致密95(PSD95)的相對表達量。結(jié)果:實驗一:曠場實驗中,各組小鼠跨越方格數(shù)和后腳站立次數(shù)相比均無明顯差異(P0.05)。Morris水迷宮實驗中,與對照組相比,手術(shù)組小鼠術(shù)后水迷宮登臺潛伏期延長(P0.05),目標象限停留時間縮短(P0.01)、穿臺次數(shù)減少(P0.05);而與手術(shù)組相比,異氟醚組和異氟醚+手術(shù)組登臺潛伏期縮短(P0.05),目標象限停留時間增加(P0.05)。條件恐懼實驗中,與對照組相比,手術(shù)組小鼠術(shù)后第1、3、7天場景測試凝滯時間百分比降低(P0.05),術(shù)后第3天聲音測試凝滯時間百分比降低(P0.05);與手術(shù)組相比,異氟醚組術(shù)后第3天場景測試凝滯時間百分比和聲音測試凝滯時間百分比均增加(P0.05),異氟醚+手術(shù)組術(shù)后第3、7天場景測試凝滯時間百分比增加(P0.05)。實驗二:免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),與其他各組相比,術(shù)后第3天手術(shù)組小鼠海馬組織SYN-1表達下降,突觸密度減少(P0.05),術(shù)后第7天各組相比無顯著差異(P0.05)。蛋白印記實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,手術(shù)組小鼠海馬組織PSD95術(shù)后第3天表達量降低(P0.05),與手術(shù)組相比,異氟醚組小鼠海馬PSD95術(shù)后第3天表達量增加(P0.05);各組小鼠海馬PSD95術(shù)后第7天表達量無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:腹部手術(shù)可致老年小鼠術(shù)后早期空間學(xué)習(xí)記憶能力和關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生損害,海馬神經(jīng)元突觸可塑性下降,而異氟醚吸入麻醉可部分逆轉(zhuǎn)腹部手術(shù)造成的認知損傷和突觸可塑性下降,具有保護作用,進一步證實POCD的發(fā)病機制之一是突觸可塑性下降所致。第二部分術(shù)后認知功能障礙老齡小鼠海馬組織microRNA表達差異分析與初步驗證目的:比較和分析術(shù)后認知功能障礙老齡小鼠海馬組織microRNA表達變化情況,并初步探索其影響認知功能的可能機制。方法:實驗一:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、28只)按體重排序,隨機分為2組:對照組(con)和手術(shù)組(sur),每組14只,分別施以假手術(shù)和局麻腹部手術(shù)。術(shù)后24h每組隨機抽取3只小鼠處死取海馬組織,抽提總RNA,行miRNA microarray基因芯片檢測兩組小鼠海馬miRNA表達情況;每組隨機抽取3只小鼠處死,抽提海馬總RNA,液氮保存以備qRT-PCR驗證實驗;每組剩余8只小鼠行Morris水迷宮實驗評價認知功能。實驗二:對實驗一 miRNA microarray基因芯片中篩選出的miRNA(表達變化1.5倍以上)利用miRanda,miRDB,miRWalk等數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測,并行GO分析及KEGG通路預(yù)測;對基因芯片篩選出的miRNA隨機抽取若干(miR-16-3p, miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p, miR-183-5p)行qRT-PCR驗證芯片結(jié)果。實驗三:老齡C57BL/6小鼠(18月齡、36只)按體重排序,隨機分為4組:對照組(con)、異氟醚組(iso)、手術(shù)組(sur)、異氟醚+手術(shù)組(iso+sur),每組9只,分別施以假手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h、局麻腹部手術(shù)、1.8%異氟醚吸入1.5h+局麻腹部手術(shù)處理,于術(shù)后第1、3、7天每組隨機處死3只小鼠取海馬組織,對與認知功能相關(guān)的 miRNA(miR-155-5p,miR-582-5p, miR-134-5p)行 qRT-PCR檢測,對上述miRNA預(yù)測的靶蛋白環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB),腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)行Western Blot檢測。結(jié)果:實驗一: miRNA microarray基因芯片檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,腹部手術(shù)后24h,手術(shù)組小鼠海馬組織miRNA表達上調(diào)1.5倍以上的有29個,表達下調(diào)1.5倍以上的有34個。Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn),腹部手術(shù)造成老齡小鼠術(shù)后登臺潛伏期延長(P0.05),目標象限停留時間縮短(P0.01)、穿臺次數(shù)減少(P0.05),空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。實驗二:通過對實驗一中篩選的表達改變1.5倍以上的miRNA進行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn),有36個miRNA與creb1(CREB基因)的表達有關(guān),有23個miRNA與bdnf(BDNF基因)的表達有關(guān)。qRT-PCR實驗顯示,隨機抽取的miR-16-3p,miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p,miR-183-5p 的表達情況與基因芯片檢測的結(jié)果相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對篩選的miRNA行GO分析發(fā)現(xiàn),涉及生物學(xué)途徑(BP)的GO Term有447個,涉及分子功能(MF)的GO Term有74個,細胞定位(CC)的有36個,多與炎癥、神經(jīng)細胞發(fā)育分化、突觸形態(tài)和功能有關(guān);行KEGG通路預(yù)測發(fā)現(xiàn)有多條與認知功能有關(guān)的信號通路被激活,如神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路(Neurotrophin signaling pathway)、環(huán)腺苷酸信號通路(cAMP signaling pathway)、長時程增強(Long-term potentiation)、絲裂原活化蛋白激酶通路(MAPK signaling pathway)等。實驗三:選取與CREB和BDNF表達調(diào)控均有關(guān)的3個miRNA,即 miR-155-5p, miR-582-5p,miR-134-5p 行 qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),與其他各組相比,術(shù)后第1天,該3個miRNA在手術(shù)組小鼠海馬中表達明顯增高(P0.05),術(shù)后第3天miR-155-5p表達依然增高(P0.05),其余miRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義,術(shù)后第7天各組小鼠海馬組織miRNA表達基本無差別。WestemBlot實驗發(fā)現(xiàn),與其他各組相比,術(shù)后第1、3天,手術(shù)組小鼠海馬組織CREB活性降低,第7天各組CREB活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義;術(shù)后第3、7天,與其他各組相比,手術(shù)組小鼠海馬組織BDNF表達量減少。結(jié)論:腹部手術(shù)可致老齡小鼠術(shù)后認知功能發(fā)生損害,與術(shù)后早期海馬中miRNA表達譜改變有關(guān)。手術(shù)引起的創(chuàng)傷、中樞炎癥、氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷等,使機體通過上調(diào)或下調(diào)miRNA的表達,對神經(jīng)元的生長和凋亡、突觸的形態(tài)和功能、膠質(zhì)細胞活化等多條信號通路進行調(diào)控,影響突觸可塑性,進而影響認知功能。其中,microRNA-CREB-BDNF通路可能是POCD發(fā)病機制之一。
【圖文】：

院動物倫理委員會許可。逡逑實驗用小鼠的排除標準是：１．小鼠頭、軀干、四肢形態(tài)異常者；２．活動明顯不協(xié)逡逑調(diào)者；３．毛發(fā)色澤欠佳或脫毛者。見圖１－１。逡逑擙逡逑圖１－１成年與老年Ｃ５７／ＢＬ６小鼠逡逑１７逡逑

逡逑圖１－２實驗一示意圖小鼠分４組（ｎ＝１６），，術(shù)前行曠場實驗（ＯＦｌ＞術(shù)后行Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮實驗逡逑（ＭＷＭ）和條件恐懼實驗（ＦＣＴ）邋ｃｏｎ：對照組；ｉｓｏ：異氟釀組；ｓｕｒ：手術(shù)組；ｉｓｏ＋ｓｕｒ：異氟酸＋手術(shù)組；逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ：行異氟越吸入處理；ｓｕｒｇｅｒｙ：行腹部手術(shù)處理逡逑實驗二：老齡Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（１８月齡、４８只）按體重編號，ＣＨＩＳＳ軟件隨機分為逡逑４組，每組１２只，分組和處理因素同實驗一。實驗流程如下（見圖１－３），行處理（ｄａｙＯ）逡逑后，于術(shù)后第３、７天隨機處死各組小鼠取腦組織，行免疫熒光染色觀察海馬組織突逡逑觸體素－ｌ（ＳＹＮ－ｌ）表達情況，行蛋白印記實驗檢測突觸后致密９５（ＰＳＤ９５）的相對表達逡逑量。逡逑邐邋ｊｎｏｎｅ逡逑ｃｏｎ（ｎ邋＝邋１２）邐１邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑邐邋ｄａｙ0邐（ｎ邋＝邋３）邐；邋邐（ｎ邋＝邋３）邐、逡逑邐邋ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ邐ｄａｙ３邐ｄａｙ７逡逑丨丨邋ｓ0＿）邐｜邐＾￣Ｑ＞邋—逡逑邐邋ｓｕｑｅｒｖ逡逑ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２）邐邐＾邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邐Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑邐Ｊ邐Ｌ邐邐ｄａｙＯ邐（ｎ邋＝邋３）邐）邐（ｎ邋＝邋３）逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ邐ｄａｙ邋３邐ｄａｙ邋７逡逑｜邋＿ｉｓｏ邋＋邋ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２ｊ＿Ｊ邐￣＾逡逑圖１－３實驗二示意圖小鼠分４組（ｎ＝１２）
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R614

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yun-zhi LING;Wei MA;Li YU;Ye ZHANG;Qi-sheng LIANG;;七氟烷麻醉誘導(dǎo)的認知功能損傷與內(nèi)測前額葉皮層中PSD95表達量降低有關(guān)（英文）[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年09期

本文編號：2560614