【摘要】：目的:1.探求單因素抑制Hesl基因表達(dá)對(duì)人GABA能神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化率的影響,尋求一種簡(jiǎn)單高效的誘導(dǎo)方法。2.改進(jìn)海水浸泡腦損傷大鼠模型制作方法,以求更好的模擬海水浸泡腦損傷。3.觀察海水浸泡腦損傷大鼠不同時(shí)間段腦內(nèi)炎癥表現(xiàn),探尋細(xì)胞移植治療的適當(dāng)時(shí)間。4.神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)聯(lián)合γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元細(xì)胞聯(lián)合移植治療對(duì)海水浸泡腦損傷大鼠的神經(jīng)功能損傷的修復(fù)作用。方法:在含有10%胎牛血清的普通分化培養(yǎng)基中添加寡核苷酸鏈“anti-hesl”組成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,在相同條件下利用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和普通分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)人神經(jīng)干細(xì)胞分化為GABA能神經(jīng)元細(xì)胞,染色鑒定。對(duì)外傷性腦損傷(TBI)大鼠模型的撞針進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn),通過灌腸袋定點(diǎn)滴注的方式模擬海水浸泡,觀察不同浸泡時(shí)間對(duì)大鼠損傷程度的影響。按改良方法對(duì)大鼠進(jìn)行造模,造模成功后第24、48、72、96小時(shí)灌注取腦組織并進(jìn)行常規(guī)HE染色及針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的DAB顯色。觀察局部組織的炎癥反應(yīng)及中樞系統(tǒng)免疫反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,聚集,分布變化。將NSCs及其誘導(dǎo)的GABA能神經(jīng)元細(xì)胞在改良海水浸泡腦損傷大鼠模型建立后第4天通過立體定向的方式將其移植至大鼠腦內(nèi),同樣造模及移植方法對(duì)模型大鼠進(jìn)行單純神經(jīng)干細(xì)胞移植,同時(shí)設(shè)置單純海水浸泡腦損傷組而不進(jìn)行細(xì)胞移植。觀察各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)及腦組織切片中移植細(xì)胞的存活及分布情況。結(jié)果:1.誘導(dǎo)第14天90%-95%細(xì)胞已完成分化。實(shí)驗(yàn)組GABA分化率64.0%,對(duì)照組僅16.6%,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P0.01。2.TBI大鼠模型海水浸泡30及45分鐘組存活率100%,60分鐘組存活率20%。神經(jīng)功能缺失3級(jí)以上,模型45分鐘組為80%,明顯高于其他兩組。3.大鼠腦損傷后48-72小時(shí):出血,水腫加重;小膠質(zhì)細(xì)胞聚集,活化,其數(shù)量較其他時(shí)段明顯增高,并有明顯的吞噬行為。72-96小時(shí)腦出血及水腫情況逐漸穩(wěn)定,小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少。4.細(xì)胞治療組神經(jīng)功能較單純損傷組均有明顯改善。聯(lián)合治療組與神經(jīng)干細(xì)胞治療組相比,在第14—31天神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS)優(yōu)于神經(jīng)干細(xì)胞治療組(P0.05),在第21天偏癱實(shí)驗(yàn)(LUA)結(jié)果優(yōu)于神經(jīng)干細(xì)胞治療組(P0.05)。結(jié)論:1.抑制Hesl基因的表達(dá)可顯著提高人NSCs誘導(dǎo)分化為GABA能神經(jīng)元的分化率。2.改良海水浸泡腦損傷大鼠模型可以較好模擬海水浸泡腦損傷特點(diǎn),滿足科研需要。3.腦損傷海水浸泡后72小時(shí)內(nèi)炎癥反應(yīng)最為強(qiáng)烈,小膠質(zhì)細(xì)胞大量聚集活化,72-96小時(shí)后逐漸減弱并趨于平穩(wěn)。4.NSCs與GABA能神經(jīng)元聯(lián)合移植對(duì)于海水浸泡腦損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有較好療效,但對(duì)其記憶功能恢復(fù)效果仍有待探究。
【圖文】：

球體中心細(xì)胞缺少氧氣及營(yíng)養(yǎng)而發(fā)生壞死，因此及時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳逡逑代后細(xì)胞增殖迅速，再次迅速形成新的細(xì)胞球體并迅速增大。培養(yǎng)至第１０天，逡逑約７０％以上的細(xì)胞球體直徑再次達(dá)１５０－２００ｕｍ邋（圖１－ｌａ）。獲得第二代神經(jīng)干細(xì)逡逑胞。細(xì)胞球ｎｅｓｔｉｎ染色陽(yáng)性（圖１－ｌｂ），證實(shí)為神經(jīng)干細(xì)胞球。逡逑■Ｈｌ｜｜逡逑１－ｌａ邐ｌ￣ｌｂ逡逑圖１－１：人類神經(jīng)干細(xì)胞球逡逑ａ為１００邋（１０＊１０）倍鏡下神經(jīng)干細(xì)胞球，ｂ為２００邋（１０＊２０）倍鏡下神經(jīng)干細(xì)胞ｎｅｓｔｉｎ逡逑免疫熒光鑒定。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋ｈｕｍ邋ａｉｌ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ逡逑ａ．邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋（１０＊１０）邋ｂ．邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑ｓｔａｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｎｅｓｔｉｎ邋（１０＊２０）．逡逑１．２．邐２邋ＧＡＢＡ能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化逡逑１．２．邐２．１培養(yǎng)觀察逡逑取第二代神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化２天后逡逑即可見細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，但大部分細(xì)胞仍處于懸浮狀態(tài)。第４天，，約半數(shù)細(xì)胞逡逑開始貼壁，少數(shù)細(xì)胞胞體開始出現(xiàn)棱角。第６天，多數(shù)細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，部分逡逑細(xì)胞伸出１－２個(gè)長(zhǎng)突起，但細(xì)胞出現(xiàn)匯聚性貼壁現(xiàn)象（圖ｌ＿２ａ箭頭處），為不影逡逑響細(xì)胞后續(xù)分化生長(zhǎng)，再次予以胰酶消化，離心，并重新接種。普通分化培養(yǎng)液逡逑組培養(yǎng)至第４天時(shí)同樣可見約半數(shù)細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，至第６天，貼壁細(xì)胞增多，逡逑細(xì)胞形態(tài)各異

球體中心細(xì)胞缺少氧氣及營(yíng)養(yǎng)而發(fā)生壞死，因此及時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳逡逑代后細(xì)胞增殖迅速，再次迅速形成新的細(xì)胞球體并迅速增大。培養(yǎng)至第１０天，逡逑約７０％以上的細(xì)胞球體直徑再次達(dá)１５０－２００ｕｍ邋（圖１－ｌａ）。獲得第二代神經(jīng)干細(xì)逡逑胞。細(xì)胞球ｎｅｓｔｉｎ染色陽(yáng)性（圖１－ｌｂ），證實(shí)為神經(jīng)干細(xì)胞球。逡逑■Ｈｌ｜｜逡逑１－ｌａ邐ｌ￣ｌｂ逡逑圖１－１：人類神經(jīng)干細(xì)胞球逡逑ａ為１００邋（１０＊１０）倍鏡下神經(jīng)干細(xì)胞球，ｂ為２００邋（１０＊２０）倍鏡下神經(jīng)干細(xì)胞ｎｅｓｔｉｎ逡逑免疫熒光鑒定。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋ｈｕｍ邋ａｉｌ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ逡逑ａ．邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋（１０＊１０）邋ｂ．邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑ｓｔａｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｎｅｓｔｉｎ邋（１０＊２０）．逡逑１．２．邐２邋ＧＡＢＡ能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化逡逑１．２．邐２．１培養(yǎng)觀察逡逑取第二代神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化２天后逡逑即可見細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，但大部分細(xì)胞仍處于懸浮狀態(tài)。第４天，約半數(shù)細(xì)胞逡逑開始貼壁，少數(shù)細(xì)胞胞體開始出現(xiàn)棱角。第６天，多數(shù)細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，部分逡逑細(xì)胞伸出１－２個(gè)長(zhǎng)突起，但細(xì)胞出現(xiàn)匯聚性貼壁現(xiàn)象（圖ｌ＿２ａ箭頭處），為不影逡逑響細(xì)胞后續(xù)分化生長(zhǎng)，再次予以胰酶消化，離心，并重新接種。普通分化培養(yǎng)液逡逑組培養(yǎng)至第４天時(shí)同樣可見約半數(shù)細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，至第６天，貼壁細(xì)胞增多，逡逑細(xì)胞形態(tài)各異
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R651.15

【參考文獻(xiàn)】

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5 賈s

本文編號(hào)：2554898