【摘要】：目的:探討同軸靜電紡技術(shù)制備的新型PLLA微陣列膜(microtube array sheet,MTAS)的神經(jīng)毒性及神經(jīng)組織相容性,檢測MTAS表面規(guī)則有序的溝槽結(jié)構(gòu)對于體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)及神經(jīng)突起的導(dǎo)向性,并使用MTAS構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管,從形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、行為學(xué)評價其修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的效果。方法:根據(jù)ISO10993-5材料毒性國際標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,制備PLLA-MTAS材料的孵育液,并用其培養(yǎng)原代SCs,觀察細(xì)胞生長狀態(tài),MTT法檢測細(xì)胞活力,Annexin V-PI雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡,之后采用Brd-U檢測細(xì)胞增殖,Transwell法觀察細(xì)胞遷移,Realtime-PCR檢測SCs重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、GDNF、NT4、BDNF、CNTF的表達(dá),評價MTAS的神經(jīng)細(xì)胞毒性及神經(jīng)組織相容性;并將SCs和神經(jīng)元分別與MTAS共培養(yǎng),激光共聚焦顯微鏡及電子掃描顯微鏡觀察SCs的形態(tài)、排布以及神經(jīng)突起的延伸狀態(tài);將MTAS襯于中空神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)壁,構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS),以中空神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit)作為對照,修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損,術(shù)后8w通過HE染色、免疫熒光、甲苯胺藍(lán)染色、電鏡、神經(jīng)電生理、足跡步態(tài)以及熱痛覺分析等方法,從形態(tài)到行為、功能,檢測復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損的效果;并在此導(dǎo)管基礎(chǔ)上,將原代SCs作為支持細(xì)胞種植于MTAS上,進一步構(gòu)建生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS+SCs),修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損,術(shù)后8w檢測生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損的效果。結(jié)果:1.MTAS由多個直徑約為50μm的電紡纖維管有序的平行排列構(gòu)成,兩個相鄰的纖維管形成了規(guī)則的“V”形溝槽結(jié)構(gòu),溝槽的平均深度為8μm,寬度為20μm。浸于37℃PBS孵育28d后,材料表面的溝槽結(jié)構(gòu)依舊規(guī)則有序,且表面溝槽的寬度無明顯變化(p0.05)。使用MTAS預(yù)處理培養(yǎng)基培養(yǎng)原代SCs后,細(xì)胞形態(tài)、活力及凋亡情況均未發(fā)生明顯變化(p0.05);SCs的增殖、遷移以及重要營養(yǎng)因子NGF、GDNF、NT4、BDNF、CNTF的表達(dá)等神經(jīng)再生過程中的關(guān)鍵生物學(xué)效應(yīng)亦未受抑制(p0.05)。MTAS材料穩(wěn)定性佳,對于神經(jīng)細(xì)胞無毒性作用,具有良好的神經(jīng)組織相容性。2.SCs與MTAS共培養(yǎng)結(jié)果顯示,SCs種植于MTAS上之后,多個SCs細(xì)胞首尾相連,沿材料表面的“V”型溝槽有序的排列,其長軸與電紡纖維管長軸的排布一致。將背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)感覺神經(jīng)元與脊髓前角運動神經(jīng)元細(xì)胞與MTAS共培養(yǎng)后,神經(jīng)突起也改變了其在普通培養(yǎng)皿上隨機生長的狀態(tài),突起聚集成束,沿MTAS表面溝槽有序生長延伸。MTAS材料的表面形貌可以引導(dǎo)體外培養(yǎng)的SCs的有序排布以及神經(jīng)突起的定向延伸,具有良好的神經(jīng)源性細(xì)胞導(dǎo)向性。3.將MTAS襯于SF/P(LLA-CL)中空神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi),構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS),以中空神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit)作為對照,修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損。結(jié)果顯示,兩種導(dǎo)管均可促進坐骨神經(jīng)再生。神經(jīng)導(dǎo)管移植8W后,免疫熒光檢測導(dǎo)管遠(yuǎn)端的神經(jīng)再生情況,長入導(dǎo)管遠(yuǎn)端的神經(jīng)纖維的面積及神經(jīng)纖維數(shù)量Conduit+MTAS組均大于Conduit組(p0.05);電鏡結(jié)果顯示:Conduit+MTAS組神經(jīng)導(dǎo)管中段再生有髓神經(jīng)纖維的直徑顯著大于Conduit組(p0.05),且Conduit+MTAS組再生神經(jīng)纖維較規(guī)則,接近正圓,離心率為0.56±0.02,與正常神經(jīng)(離心率為0.59±0.01)形態(tài)類似,而Conduit組的髓鞘神經(jīng)纖維形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則形及長條形,離心率達(dá)0.83±0.02,二者存在統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);高倍電鏡結(jié)果顯示再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu),觀察再生神經(jīng)突起的微管、微絲及周圍的膠原纖維:Conduit+MTAS組呈規(guī)則的點狀分布,而Conduit組則呈現(xiàn)點狀和短線狀交錯分布的狀態(tài);計算腓腸肌恢復(fù)率及單個肌細(xì)胞面積,結(jié)果顯示Conduit組肌肉萎縮狀況明顯較Conduit+MTAS組嚴(yán)重(p0.05);另外Conduit+MTAS組與Conduit組均有再生神經(jīng)纖維長入腓腸肌,且再生的神經(jīng)終末纖維與肌肉建立聯(lián)系,形成了運動終板,單位面積運動終板計數(shù)Conduit+MTAS組優(yōu)于Conduit組(p0.05);兩組足底皮膚也均有再生神經(jīng)纖維長入,有部分再生神經(jīng)纖維從皮膚基底層長入表皮,再生神經(jīng)的密度Conduit+MTAS組優(yōu)于Conduit組;神經(jīng)電生理結(jié)果顯示:Conduit+MTAS組的CMAP峰值也顯著高于Conduit組的(p0.05);以熱痛閾值測量和坐骨神經(jīng)指數(shù)的行為學(xué)實驗分別檢測大鼠感覺及運動功能恢復(fù)狀況,結(jié)果顯示:兩組大鼠的感覺功能無顯著差異(p0.05);Conduit+MTAS組大鼠運動功能恢復(fù)優(yōu)于Conduit組(p0.05)。綜上結(jié)果顯示:MTAS材料具有良好的神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向性,可以引導(dǎo)再生過程中神經(jīng)纖維的有序延伸,加快再生神經(jīng)對靶器官的再支配,促進神經(jīng)缺損損傷后的功能恢復(fù)。4.以復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS)為基礎(chǔ),在MTAS上種植支持細(xì)胞-原代SCs,構(gòu)建生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS+SCs)。比較兩組再生有髓神經(jīng)纖維的密度、直徑、髓鞘厚度、G值,皮膚、肌肉神經(jīng)的再支配程度、腓腸肌濕重、單個肌細(xì)胞面積及CMAP峰值;并進行熱痛閾值和坐骨神經(jīng)指數(shù)的測量,結(jié)果顯示:除再生有髓神經(jīng)纖維的直徑及熱痛閾值二組無顯著性差異外,其余各測量指標(biāo)Conduit+MTAS+SCs組均顯著優(yōu)于Conduit+MTAS組(p0.05)。以復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS)為基礎(chǔ)構(gòu)建的具有支持細(xì)胞-SCs的生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管(Conduit+MTAS+SCs)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損,可以進一步提高神經(jīng)再生的效率。結(jié)論:由多個PLLA電紡纖維管平行排布構(gòu)成的新型微陣列膜MTAS材料,具有規(guī)則的“V”型溝槽表面結(jié)構(gòu)。本研究體內(nèi)、體外實驗相結(jié)合,首次證明此材料穩(wěn)定性佳,無神經(jīng)毒性,具有良好的神經(jīng)組織相容性,其表面特殊的形貌修飾可以促進體外培養(yǎng)的SCs有序排布及神經(jīng)突起的定向延伸,具有良好的神經(jīng)源性細(xì)胞導(dǎo)向性;以MTAS材料構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管,修復(fù)周圍神經(jīng)缺損,有利于神經(jīng)再生及感覺、運動功能恢復(fù),其效果顯著優(yōu)于中空神經(jīng)導(dǎo)管組;將SCs作為支持細(xì)胞,修飾MTAS構(gòu)建的復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管,可以進一步提高神經(jīng)再生的效率。本研究顯示:MTAS是一種有潛力的神經(jīng)組織工程材料,其特有的表面形貌為神經(jīng)組織工程的材料修飾提供了新的方法和思路,MTAS可以構(gòu)建復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管,修復(fù)周圍神經(jīng)缺損,促進神經(jīng)再生。本研究還為以MTAS為基礎(chǔ),進一步構(gòu)建具有支持細(xì)胞的生物型復(fù)合神經(jīng)導(dǎo)管提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.同軸靜電紡絲技術(shù)模式圖Fig 1. Model diagram of Coaxial electrospinning technology層溶液和殼層溶液分別置于兩個推進容器中， 在復(fù)合毛細(xì)噴頭端口處匯集并形成芯-殼結(jié)復(fù)合液滴， 復(fù)合液滴在外加高壓電場作用下，形成芯-殼結(jié)構(gòu)的噴射細(xì)流，并在電場中運動材料本身表面張力、靜電排斥力和庫侖力的共同作用下，溶劑蒸發(fā)、材料固化，最終形成徑很小的芯-殼結(jié)構(gòu)纖維。同軸靜電紡絲技術(shù)制備的組織工程材料優(yōu)點如下：1.通過選擇適當(dāng)?shù)男緦�、殼合物材料，調(diào)整加工條件，即可以獲得降解速率可控、材料厚度、結(jié)構(gòu)等機械優(yōu)越和力學(xué)性能最佳的纖維材料；2.靜電紡纖維具有較高的孔隙率，有利于氧營養(yǎng)物質(zhì)的交換和代謝物的排泄，比表面積（每克物質(zhì)中所有顆�？偼獗砻娣e）大，有利于細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化以及 ECM 的分泌，為細(xì)胞的生供了良好的微環(huán)境；3.采用靜電紡絲法制備的聚合物材料由納米或亞微米級的纖維構(gòu)成，與天然ECM中纖維的尺寸非常接近，這種類似ECM的特殊物理信號有利于細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化； 4.另外，，通過對材料表面的物理化學(xué)

圖 2.Realtime PCR 程序設(shè)置Fig 2. Reaction conditions of Realtime PCRf.1h 后收取反應(yīng)結(jié)果，ΔΔCt 法分析實驗結(jié)果。1.4 統(tǒng)計方法實驗獲得數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism Version 6.0c 軟件進行整理和統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用 Student's t-test 分析其統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計檢驗得到的概率 p<0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R651.3

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本文編號：2551973