【摘要】：骨的代謝及形成障礙大部分是由感染他等因素造成的炎癥反應直接干擾,而炎癥反復影響,長期存在。在中國,每年骨折患者約有5000萬例,其中骨折不愈合的發(fā)病率約為5%-10%,主要因為骨折內(nèi)固定術(shù)后或開放性骨折術(shù)后繼發(fā)感染或其它因素引起持續(xù)的炎癥反應的導致。骨折的愈合過程,即壞死骨碎片溶解加上骨基質(zhì)大量形成、礦化的過程。其過程主要包括成骨細胞的成骨和破骨細胞的溶骨。兩者的作用相互拮抗制約,達到一定的動態(tài)平衡。一般情況下,創(chuàng)傷骨折或骨病中的炎癥反應能刺激機體啟動生理功能,抵抗并排除損害因素,修復損傷的骨組織,促進骨折的愈合。但是組織長期過度地受炎性損害,機體難以形成骨質(zhì),甚至遭受骨質(zhì)的進一步破壞溶解。近些年來,越來越多的科學家開始研究有關(guān)炎性因子與成骨細胞和破骨細胞之間的關(guān)系,其中慢性持續(xù)性的炎癥可加快骨吸收過程的相關(guān)研究已較為成熟。然而在另一方面,慢性持續(xù)性的炎癥對成骨細胞的代謝的作用尤其是對成骨細胞分化相關(guān)的研究尚未成熟,其相互作用與具體機制至今未明確。成骨細胞分化涉及多條細胞信號通道轉(zhuǎn)導機制,某些通路之間存在相互交談(cross talk)、相互影響,在炎癥刺激下其調(diào)節(jié)過程更為復雜精細,即使研究某一條或多條通路也難以明確成骨細胞在炎癥刺激下的形成及分化過程。在未來的生物醫(yī)學研究里,從多個炎癥發(fā)展階段、多個細胞信號通路靶點進行干預和控制炎癥才是骨再生研究的發(fā)展方向。通過深入研究炎癥對成骨細胞分化的影響及其相關(guān)干預機制,并在炎癥通路下找出特異性的可控靶點,才能多層次多靶點的控制炎癥,促進成骨分化,實現(xiàn)抗炎、促成骨的新藥物的開發(fā)。蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的成熟導致后基因組時代的到來,蛋白質(zhì)是生物功能更直接的執(zhí)行者,成為現(xiàn)今生命科學領(lǐng)域中的研究熱點。蛋白質(zhì)組學技術(shù)定義是：對機體、組織或細胞的所有蛋白質(zhì)的表達水平、功能及它們之間的相互作用關(guān)系進行高通量的篩選和定量定性分析,比以往通過單個基因、蛋白來研究疾病的診療更加可靠,機體狀態(tài)的反映更準確。運用傳統(tǒng)的生化技術(shù),如基于雙向凝膠電泳分析-質(zhì)譜鑒定技術(shù),逐個地去研究大量的蛋白質(zhì),篩查檢測的工作量龐大而難以完成,更別說從中發(fā)現(xiàn)新的發(fā)病機制。iTRAQ技術(shù)比起傳統(tǒng)的技術(shù)如2-DE,具有更高通量和高靈敏度的分析能力,運用在比較蛋白質(zhì)組學研究中具有突出的優(yōu)勢。通過比較機體在健康和炎癥狀態(tài)下的成骨分化的蛋白質(zhì)表達的差異變化,能獲得大量候選標志物蛋白。然而,這些大量候選標志物蛋白與疾病的發(fā)生發(fā)展過程的更明確的關(guān)系及其特異性檢測驗證是目前研究生物標志物工作的一大難題�；谫|(zhì)譜的多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring, MRM)技術(shù)驗證和檢測進行生物標志物,可以通過高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)挑選出目標蛋白。該技術(shù)并不需進行合成特異性抗體,因此比起RT-PCR和Western-blot等需要抗體檢測的技術(shù),其更具有優(yōu)勢。使用不同水平的驗證技術(shù)研究,驗證基于iTRAQ技術(shù)NBD多肽改善TNF-α抑制成骨細胞分化的蛋白質(zhì)組學分析鑒定結(jié)果是否可靠,能明確進一步研究的可行性,同時也能更全面地認識炎癥刺激下成骨細胞分化機制及差異標記物蛋白的功能性質(zhì),為后續(xù)標志物的驗證、功能驗證建立基礎(chǔ),所以非常必要。本實驗研究包括三部分內(nèi)容：第一章NBD多肽改善TNF-α抑制成骨分化模型建立及驗證C2C12細胞經(jīng)BMP-2誘導進行成骨分化,炎癥刺激物TNF-α抑制C2C12肌原細胞的成骨分化,NBD多肽在炎癥刺激影響成骨分化過程中抑制炎癥反應。實驗的細胞培養(yǎng)完成后將進行組織化學染色檢測ALP活性及ALP熒光定量分析以此來驗證模型的有效性。以此作為下一步iTRAQ技術(shù)的蛋白組學實驗分析建立基礎(chǔ)。第二章基于iTRAQ技術(shù)NBD多肽改善TNF-α抑制成骨細胞分化的蛋白質(zhì)組學分析本部分研究擬使用上一章節(jié)中以TNF-α作為炎癥刺激物、NBD多肽作為炎癥抑制劑作用在BMP2誘導的肌原前體C2C12細胞分化為成骨細胞的模型,將采用iTRAQ化學標簽分別標記炎癥刺激組、NBD多肽作用組和正常分化組中細胞分離出的蛋白樣品,使用多維液相色譜分離-串聯(lián)質(zhì)譜來鑒定,從而篩選出潛在的可能與炎癥刺激與炎癥受抑制下成骨細胞分化過程相關(guān)的差異性蛋白。第三章NBD多肽改善TNF-α抑制成骨細胞分化相關(guān)的差異蛋白的MRM表達驗證本部分研究采用基于質(zhì)譜的多反應監(jiān)測(MRM)技術(shù)分析差異蛋白,為NBD多肽在改善TNF-α對成骨分化抑制的作用機制的進一步研究及差異蛋白的篩查提供依據(jù)。材料方法：1.細胞模型的建立：實驗細胞來自小鼠肌源細胞株C2C12。將其分為3組,加入不同刺激物繼續(xù)培養(yǎng)。①B組,即BMP組,在實驗組細胞培養(yǎng)液中加入BMP-2,濃度為100 ng/ml；②BT組,即BMP+TNF組,在實驗組細胞培養(yǎng)液中同時加入BMP-2 和 TNF-α, BMP-2濃度為100ng/ml, TNF-α濃度則是5 ng/ml；③BTP組,即BMP+TNF+NBD多肽組。經(jīng)過堿性磷酸酶(ALP)熒光活性測定及染色測定：檢測C2C12成骨分化的情況。將其以5×103個/孔比例接種于24孔板內(nèi)培養(yǎng)。3天后進行ALP活性用熒光檢測試劑盒檢測,采用PNPP法測定其ALP的活性,選擇波長405 nm,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值,記錄結(jié)果。培養(yǎng)的第7天進行染色實驗,按照Alkaline Phosphatase Staining Kit操作說明書進行。2.采用iTRAQ技術(shù)及生物信息學分析篩選差異蛋白：細胞的蛋白質(zhì)經(jīng)過抽提及定量,使用iTRAQ試劑對其標記及檢測。然后進行預備LC/MS/MS分析、強陽離子(SCX)交換,再經(jīng)過反相液相色譜分離、ESI質(zhì)譜鑒定。最后對分析數(shù)據(jù),檢索和鑒定蛋白,篩選出差異蛋白。2.1.差異蛋白生物信息學分析：對差異蛋白進行GO分析、COG注釋、GO富集以及Pathway顯著性分析,以此來研究差異蛋白密切相關(guān)的主要生物功能、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導通路。3.MRM:選擇目標蛋白Transition篩選后在MRM+EPI模式下驗證transition的色譜峰,再經(jīng)過MRM檢測其子離子的峰強度,整合計算離子峰面積,最后比較不同樣本中的目標蛋白表達豐度。4.統(tǒng)計分析：采用SPSS統(tǒng)計軟件(版本13.0)處理數(shù)據(jù)。采用單向方差分析比較多組均數(shù),進行方差齊性檢驗時,若方差齊采用LSD法,方差不齊時則采用Kruskal-Wallis法。檢驗水準為a=0.05。結(jié)果1.ALP染色測定結(jié)果結(jié)果顯示：B組呈現(xiàn)藍色顆粒分布；BT組與B組相比,其細胞培養(yǎng)孔里呈現(xiàn)出的藍色顆粒較弱,表明BT組的ALP活性明顯降低；BTP組的藍色顆粒分布比BT組增加。ALP熒光活性測定結(jié)果3組成骨細胞的成骨分化活性差異有統(tǒng)計學意義(F=225.80,P=0.00)。各組進行多重比較,BT組比B組成骨細胞的成骨分化活性降低(P0.05),提示TNF-α抑制BMP-2誘導的成骨細胞分化；BTP組相比起B(yǎng)T組,成骨活性明顯增強(P0.05)。2.iTRAQ試劑標記3組C2C12肌原細胞(BMP-2, TNF-a, BMP-2+TNF-a+NBD),根據(jù)篩選LC MS/MS鑒定分析結(jié)果,B組與BT組(b_B_114-VS-e_BT_118)兩組達到定量標準(比值≥1.5或≤0.6)的蛋白76個,其中BT組中上調(diào)的蛋白質(zhì)有59個,BT組中下調(diào)的蛋白質(zhì)有17個。BT組與BTP組(b_BT_118-VS-f_BTP_119)兩組定量標準(比值≥1.5或≤0.6)的蛋白數(shù)有43個,其中BTP組中上調(diào)的蛋白質(zhì)有25個,BTP組中下調(diào)的蛋白質(zhì)有18個。NPC1蛋白共鑒定出3張譜圖,經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析后均為NPC1蛋白。對BVSBT組間差異蛋白與BT VS BTP組間差異蛋白做交集處理,篩選得到8表達差異的蛋白質(zhì),即1)Periostin,2) SERCA3B,3) Scafl,4) Actn2,5) Atp5d,6) Elp2,7) Atp51及8) Npcl。3.通過MRM檢測目標蛋白子離子的峰強度,整合計算離子峰面積的大小,從而可以比較目標蛋白在不同樣本中的表達差異。成骨分化受到炎癥刺激受抑制是,表達上調(diào)的蛋白質(zhì)為E lp2,Atp5d。其中Elp2上升幅度最大；表達下調(diào)的為Actn2, Atp51 及Npc1,Atp2a3 (SERCA3B);當加入NBD多肽改善炎癥反應,Elp2,Atp5d出現(xiàn)表達下調(diào),其余蛋白質(zhì)趨向水平化。結(jié)論1.NBD多肽改善TNF-α抑制BMP-2誘導的C2C12肌源細胞成骨分化實驗可認為改善炎癥抑制成骨分化模型,經(jīng)驗證有效。2. iTRAQ技術(shù)及生物信息學分析篩選得到8個炎癥刺激成骨細胞分化過程中差異蛋白,即Periostin, SERCA3B, Scafl,Actn2, Atp5d, Elp2, Atp51及Npcl,與改善炎癥抑制成骨分化有密切關(guān)系。3.MRM的驗證檢測結(jié)果與iTRAQ篩查分析的通過比較,兩者的分析結(jié)果具有一致性。
【圖文】：

＿１１８）兩組各個蛋白質(zhì)豐度Ｗ２為底數(shù)，取對逡逑數(shù)而作出蛋白質(zhì)豐度比分布如圖２－７。蛋白表達上調(diào)的位于橫坐標為０的右側(cè)，逡逑表達量下調(diào)的位于橫坐標０的左側(cè)（紅色表示上調(diào)，綠色為下調(diào)）。達到定量逡逑標準（比值＞１．５或《０．６）的蛋白７６個，其中ＢＴ組中上調(diào)的蛋白質(zhì)有巧個，逡逑ＢＴ組中下調(diào)的蛋白質(zhì)有１７個（表２－４）。圖２－８為差異衷達蛋白質(zhì)代表ＡＣＴＮ２逡逑（ｓｐ｜Ｑ９Ｊ１９１１ＡＣＴＮ２＿ＭＯＵＳＥ）的二級質(zhì)譜鑒定代表圖。ＡＣＴＯ２蛋白共鑒定出２逡逑張譜圖，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析后均為ＡＣＴＮ２蛋白。逡逑２７逡逑

綠色為衷達量下調(diào)）。最終達到嚴格定量標準（比值＞１．５或《０．６）的蛋白數(shù)有逡逑４３個，其中ＢＴＰ組中上調(diào)的蛋白質(zhì)有２５個，ＢＴＰ組中下調(diào)的蛋白質(zhì)有１８個（表逡逑２－４）。圖２－８為差巧農(nóng)達蛋白質(zhì)代巧ＮＰＣ１邋（ｓｐ｜Ｏ３％０４｜ＮＰＣｌ＿ＭＯＵ化）的二級逡逑質(zhì)譜鑒定代巧圖。ＮＰＣ１蛋白共鑒定出３張譜圖，，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對分析后均為ＮＰＣ１逡逑蛋白。逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｒａｔｉｏ邋邊ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（ｅ＿ＢＴ＿１１８＂ＶＳ＂ｆ＿ＢＴＰ＿１１９）逡逑ｉｊ邋１逡逑Ｉ邋Ｉ：逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑－１０邐－５邐０邐５邐１０逡逑ｌｏｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｒａｔｉｏｓ），ｗｈｈ邋ｂａｓｅ邋＝邋２逡逑圖２－７邋ＢＴ組與ＢＴＰ組蛋ｎ質(zhì)豐度分布逡逑Ｆ＂ｉｇ．２－７邋Ｐｒｏ化ｉｎ邋ｒａｔｉｏ邋ｄｉｓｔｒｉ
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R683

【共引文獻】

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1 呂俊鳥;鄭良s

本文編號：2528257