【摘要】：【目的】本研究旨在獲取非人靈長類動物雪旺細(xì)胞高效激活方法、高表達(dá)營養(yǎng)因子的關(guān)鍵技術(shù),制備出標(biāo)準(zhǔn)化非人靈長類動物脊髓損傷的模型,進(jìn)而移植激活態(tài)的雪旺細(xì)胞修復(fù)靈長類動物損傷的脊髓,通過行為學(xué)評分,感覺誘發(fā)電位及運(yùn)動誘發(fā)電位檢測、組織學(xué)等觀察其療效,建立療效評價(jià)平臺,確定激活態(tài)雪旺細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的移植時(shí)間與移植濃度,從而規(guī)范化細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),為臨床激活態(tài)雪旺細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供參考指標(biāo)和依據(jù)。【方法】1.雪旺細(xì)胞原代培養(yǎng)前7天結(jié)扎食蟹猴雙下肢腓腸神經(jīng),采用胰酶和膠原酶兩種傳代純化雪旺細(xì)胞,體外培養(yǎng)5天后采用S100免疫熒光染色方法鑒定雪旺細(xì)胞,DAPI染色標(biāo)記細(xì)胞核,檢測雪旺細(xì)胞純度。2.分離純化培養(yǎng)雪旺細(xì)胞,加入重組白介素-11(IL-11)分別采用RT-qPCR和Western boltting檢測雪旺細(xì)胞髓鞘蛋白的表達(dá),進(jìn)一步檢測IL-11調(diào)控髓鞘蛋白表達(dá)的相關(guān)情況。3.采用SS-II型大動物脊髓打機(jī)器(打擊頭直徑5mm,打擊沖量50g×50mm)制作非人靈長類動物脊髓損傷模型。模型制作完成后,采用基本行為學(xué)評分,籠內(nèi)攀爬實(shí)驗(yàn),改良Tarlov評分等行為學(xué)評分系統(tǒng)和體感誘發(fā)電位、運(yùn)動誘發(fā)電位神經(jīng)評分系統(tǒng)檢測雙下肢功能情況,確定脊髓損傷模型的穩(wěn)定性。4.食蟹猴脊髓損傷后7天,在損傷部位多點(diǎn)微量注射激活態(tài)雪旺細(xì)胞,每點(diǎn)微量注射10μl,共計(jì)30μl,細(xì)胞濃度:2-3×105/μl,純度95%,采用體感誘發(fā)電位、運(yùn)動誘發(fā)電位及改良Tarlov評分等行為學(xué)評分方法檢測雙下肢功能,并通過HE染色方法和免疫組織化學(xué)染色觀察組織學(xué)變化。【結(jié)果】1.經(jīng)過兩輪差速消化后,低濃度Ⅱ型膠原酶消化組雪旺細(xì)胞純度為(96.1±1.68)%;對照組雪旺細(xì)胞純度為(80.1±4.77)%,兩組之間存在顯著性差異,P0.01。2.白介素-11可以顯著提高雪旺細(xì)胞中周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22的表達(dá)水平,而對雪旺細(xì)胞中髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白零的表達(dá)水平則沒無明顯影響,該生理作用可被JAK特異性抑制劑AG490所抑制。并且在經(jīng)過IL-11處理的SCs細(xì)胞中可以觀察到pJAK2(Y1007+Y1008)和pSTAT3(Y705)含量明顯高于對照組且伴隨著SCs中g(shù)p130表達(dá)的上調(diào)。3.脊髓損傷組食蟹猴雙下肢體感誘發(fā)電位和運(yùn)動誘發(fā)電位潛伏期延遲,波幅降低,行為學(xué)評價(jià)顯示脊髓損傷組較假手術(shù)組雙下肢運(yùn)動能力明顯下降。4.在脊髓脊髓磋傷后第7天,在損傷部位多點(diǎn)微量注射激活態(tài)雪旺細(xì)胞,每點(diǎn)微量注射10μl,共計(jì)30μl,細(xì)胞濃度:2-3×105/μl,移植組HE染色顯示空洞明顯小于損傷組,GFAP染色顯示膠質(zhì)瘢痕面積小于損傷組(P0.05),NF200染色顯示軸突生長大于損傷組(p0.05),行為學(xué)評分示移植組下肢功能恢復(fù)情況較損傷組有明顯的好轉(zhuǎn)�！窘Y(jié)論】1.確定了雪旺細(xì)胞的自體來源,利用較少的神經(jīng)組織在短時(shí)間內(nèi)獲得大量高純度雪旺細(xì)胞。并且該培養(yǎng)方法未使用毛喉素等促進(jìn)有絲分裂劑和阿糖胞苷等抑制成纖維細(xì)胞生長的物質(zhì),符合臨床應(yīng)用的要求,為自體雪旺細(xì)胞移植在臨床的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2.IL-11可通過調(diào)劑gp130/JAK2/STAT3信號通路以促進(jìn)雪旺細(xì)胞中周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22的表達(dá),從而在體外能更好的激活雪旺細(xì)胞。3.體感誘發(fā)電位和運(yùn)動誘發(fā)點(diǎn)位作為一種定量、客觀的脊髓電生理檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確性好,靈敏度高的特點(diǎn),可作為非人靈長類動物肢體功能評價(jià)的依據(jù)。行為學(xué)評分作為一種經(jīng)典的評價(jià)方法,具有方便易行和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。本研究將脊髓損傷模型與電生理檢測和行為學(xué)評分相結(jié)合,確保了模型制作的一致性,精確性,可重復(fù)性和經(jīng)濟(jì)實(shí)用性原則。4.在食蟹猴脊髓挫傷后第7天,在損傷部位多點(diǎn)微量注射激活態(tài)雪旺細(xì)胞,每點(diǎn)微量注射10μl,共計(jì)30μl,細(xì)胞濃度:2-3×105/μl,該移植途徑以及移植劑量可為臨床治療脊髓損傷提供一定的指導(dǎo)意義,從而使細(xì)胞治療脊髓損傷更具安全化,有效化,標(biāo)準(zhǔn)化。
【圖文】：

代培養(yǎng)48h后，鏡下可見細(xì)胞貼壁良好，其中混有較多成纖維細(xì)頭）（40x）細(xì)胞的純度鑒定顯微鏡下觀察，每組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在600×高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視呈綠色的為S100陽性細(xì)胞，可鑒定為雪旺細(xì)胞。經(jīng)DAPI染色色，為細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核合成(圖2)所示，僅有細(xì)胞核染色的細(xì)經(jīng)過計(jì)算，兩次純化后低濃度Ⅱ型膠原酶消化組SCs純度為（低濃度胰蛋白酶消化組SCs純度為（80.1±4.77）%。經(jīng)獨(dú)立樣本在顯著性差異，P<0.01（SPSS 22.0）。

論文 一．非人靈長類動物高純度雪旺細(xì)胞原代培養(yǎng)方法12圖2. 經(jīng)過2次純化后SCs免疫熒光染色。綠色熒光為S100，，代表SCs，僅有細(xì)胞核染色的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞； DAPI染細(xì)胞核，（1）A、B、C為0.05%胰酶提純的SCs照片，D、E、F為0.05%Ⅱ型膠原酶提純的SCs照片；（2）圖A為圖B、C合并，圖D為圖E、F合并。（3）由圖可見，經(jīng)過低濃度Ⅱ型膠原酶提純的SCs純度明顯高于低濃度胰蛋白酶提純的SCs（600×）1.2.3. 雪旺細(xì)胞的增殖能力為了評估雪旺細(xì)胞的增殖能力，取經(jīng)過2次純化后的SCs接種在24孔板中
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2526496