【摘要】：乳腺癌,是全世界三大最常見的惡性腫瘤之一(其它兩大為肺癌和結(jié)腸癌),是女性中最常見、發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤,嚴(yán)重影響著女性健康。而轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。因此,乳腺癌轉(zhuǎn)移是亟待解決的問題。雷公藤紅素(celastrol,Cel)作為一種從傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的天然化合物,高效低毒,具有廣普的抗腫瘤活性,能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,然而它在抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移方面還缺乏足夠的認(rèn)識。TNF-α,是TNF家族中的一員,是一種由巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞活化產(chǎn)生的多功能促炎細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α參與多種腫瘤轉(zhuǎn)移過程,具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。本文以Cel對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及TNF-α促轉(zhuǎn)移的影響進(jìn)行研究。本文進(jìn)行如下的探究:MTT檢測MDA-MB-231細(xì)胞在Cel和(或)TNF-α作用下處理一定時(shí)間后的細(xì)胞活性。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的粘附能力。傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力。Transwell檢測細(xì)胞的侵襲能力。小管生成實(shí)驗(yàn)檢測體外小管生成能力。Western blot檢測TMEM100、SMAD1蛋白水平的表達(dá)量變化和SMAD1/5的磷酸化。qPCR檢測基因ATF2、ACVR1(ALK1)、SMAD4、TGFβ的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化。本文的研究結(jié)果如下:(一)Cel影響乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)MTT檢測顯示:Cel不同濃度處理MDA-MB-231細(xì)胞12、24、36 h后,隨著藥物濃度增大,Cel的抑制作用增強(qiáng),且具有一定的劑量和時(shí)間依賴性。(2)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Cel濃度越大,細(xì)胞粘附率逐漸減小,表明Cel能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的粘附能力。(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:Cel濃度增大,MDA-MB-231細(xì)胞同P-選擇素結(jié)合的比例減少,進(jìn)一步表明Cel能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的粘附能力。(4)傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著Cel濃度增大,細(xì)胞遷移距離越小,明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力。(5)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著Cel濃度增加,穿過膜的細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,這表明Cel顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。(6)小管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隨著Cel濃度增大,MDA-MB-231細(xì)胞形成小管的數(shù)目減少,且管腔不完整程度增大,表明Cel能抑制MDA-MB-231細(xì)胞體外小管生成。(7)Western blot結(jié)果顯示:Cel促進(jìn)TMEM100、SMAD1蛋白表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)SMAD1/5的磷酸化。(8)qPCR結(jié)果顯示:Cel促進(jìn)ACVR1基因表達(dá),下調(diào)TGFβ信號通路相關(guān)基因表達(dá)。(二)Cel影響TNF-α促轉(zhuǎn)移初探實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)MTT檢測顯示:TNF-α能夠促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞活性,而Cel濃度越大,則越顯著地抑制其對MDA-MB-231細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。(2)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TNF-α增大MDA-MB-231細(xì)胞的粘附率,表明TNF-α能增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞粘附能力;而加入Cel后粘附率顯著下降,這表明Cel抑制TNF-α對MDA-MB-231細(xì)胞粘附的促進(jìn)作用。(3)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:TNF-α促進(jìn)P-選擇素/MDA-MB-231細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)一步表明其能促進(jìn)細(xì)胞粘附;而Cel加入后則顯著降低P-選擇素/MDA-MB-231細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)一步表明Cel能抑制TNF-α對MDA-MB-231細(xì)胞粘附的促進(jìn)作用。(4)傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TNF-α處理增大細(xì)胞的遷移距離,表明TNF-α能增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力;而Cel濃度越大,則減少TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移距離,表明Cel能夠抑制TNF-α對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用。(5)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TNF-α作用增加穿過膜的細(xì)胞數(shù)目,表明其促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲;而Cel可明顯減少穿過膜的細(xì)胞數(shù)目,表明Cel可抑制TNF-α對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。(6)小管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:TNF-α能促進(jìn)小管形成;而加入Cel后,小管數(shù)目顯著減少,且管腔不完整,表明Cel可抑制TNF-α誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞體外管腔形成。(7)qPCR結(jié)果顯示:TNF-α上調(diào)TGFβ信號通路相關(guān)基因表達(dá),而Cel抑制TNF-α對TGFβ信號通路相關(guān)基因的上調(diào)。通過以上兩部分實(shí)驗(yàn),我們初步得到Cel抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,同時(shí)抑制TNF-α促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的轉(zhuǎn)移。Cel通過促進(jìn)SMAD1/5的磷酸化,增強(qiáng)ACVR1/SMAD1/5信號,促進(jìn)TMEM100表達(dá),從而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。此外,Cel在轉(zhuǎn)錄水平上抑制TGFβ信號通路,促進(jìn)TMEM100表達(dá)。Cel通過下調(diào)TGFβ信號抑制TNF-α對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。因此,本文對Cel在抗乳腺癌的轉(zhuǎn)移以及抑制TNF-α促轉(zhuǎn)移機(jī)理進(jìn)行初步研究,為Cel在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù),為Cel的臨床癌癥治療奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線

腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞形tured morphology of human breast cancer cells胞 MDA-MB-231 轉(zhuǎn)移 293-T 細(xì)胞活性的影響0.5、1、2、4、8 μmol·L-1的 Cel 分別處其細(xì)胞活性。如圖 3-2 所示，，Cel 處理
【學(xué)位授予單位】：西華師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2521854