【摘要】：背景和目的:炎癥反應(yīng)在腎缺血再灌注(renal ischemia/reperfusion,r I/R)導(dǎo)致的急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的病理生理過程中,發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。膽堿能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway CAP)激活,即中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過迷走神經(jīng)及其煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,n ACh Rs)來調(diào)控局部和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)以維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。應(yīng)用藥物或迷走神經(jīng)電刺激均能夠抑制過度增強的炎癥反應(yīng),從而對腎缺血再灌注損傷起到一定的預(yù)防和保護作用。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一種新型的的高選擇性α2腎上腺素受體(α2 adrenergic receptor,α2AR)激動劑,目前作為一種麻醉輔助藥物已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉、重癥監(jiān)護等,在發(fā)揮鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、阻滯交感等作用的同時,還具有強力的抗炎和潛在的器官保護作用。我們前期的研究也已經(jīng)證實,Dex在雙側(cè)腎缺血再灌注所致的急性腎損傷以及由此導(dǎo)致的遠端肺損傷的小鼠模型中,具有明確的器官保護作用。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)給予Dex可以明顯增強迷走神經(jīng)活性,降低血清兒茶酚胺(catecholamine,CA)水平并增加乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)水平,同時降低血清炎癥介質(zhì)水平,減少腎臟細胞凋亡和腎組織病理變化,提供明確的腎保護作用。而在給予了α2AR拮抗劑阿替美唑(atipamezole,Atip)后再應(yīng)用Dex,其抗炎作用消失,說明Dex的抗炎效應(yīng)是通過α2AR的活化從而激活CAP來實現(xiàn)的。同樣地,持續(xù)電刺激迷走神經(jīng)(vagus nerve stimulation,VNS)也能發(fā)揮類似的抗炎效應(yīng),但在切斷迷走神經(jīng)后再給予Dex其抗炎作用消失。通過本研究擬證實,Dex發(fā)揮其抗炎效應(yīng)依賴于α2AR的活化及迷走神經(jīng)的完整性,它可以通過CAP的激活從而減輕r I/R所致的急性腎損傷而發(fā)揮腎保護作用。方法:1.迷走神經(jīng)放電頻率采集與分析1.1分離小鼠右側(cè)頸部迷走神經(jīng),將其置于鉑金電極頭掛鉤上,利用BL-420F信息采集和分析系統(tǒng)采集分析其放電頻率1.2持續(xù)記錄迷走神經(jīng)放電在單獨給予Dex或r I/R期間的變化1.3檢測給予Dex后r I/R期間迷走神經(jīng)放電的變化情況1.4檢測給予阿替美唑后再給予Dex其迷走神經(jīng)放電在r I/R期間的變化情況2.血清ACh和CA檢測分析2.1小鼠ELISA ACh和CA試劑盒檢測小鼠血清ACh和CA水平2.2分別對不同處理組的小鼠血清ACh和CA水平進行檢測分析3.血清炎癥介質(zhì)檢測3.1 Aimplex?Mouse Inflammation 8-Plex assay kits檢測血清炎癥介質(zhì)水平3.2流式細胞術(shù)檢測樣本中抗原抗體復(fù)合物,FCAP Array 3.0分析其中各炎癥介質(zhì)水平4.腎臟損傷組織學(xué)觀察及病理學(xué)評分4.1 HE染色切片鏡下觀察并采集圖像4.2盲法評估組織病理學(xué)評分5.腎小管上皮細胞凋亡檢測(TUNEL法)5.1 In Situ Cell Death Detection Kit,POD檢測腎小管上皮細胞凋亡情況5.2隨機采集10個視野/片,利用Image J軟件統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù),計算陽性率結(jié)果:1.Dex和r I/R均能顯著增加小鼠頸部迷走神經(jīng)放電頻率,給予阿替美唑可導(dǎo)致Dex的該效應(yīng)消失但對r I/R無明顯影響。2.腎缺血再灌注對血清ACh和CA水平無明顯影響,但給予Dex或VNS可顯著增加血清ACh水平并降低CA水平,且不受切脾與否的影響。而給予阿替美唑和迷走神經(jīng)切斷后再給予Dex可導(dǎo)致其ACh水平下降。3.腎缺血再灌注可導(dǎo)致血清IL-1β,IL-6,TNF-α,IL-10,VEGF,s ICAM-1和s P-selectin等因子水平顯著升高,給予Dex或VNS可顯著降低上述炎癥因子水平,但對s VCAM-1無明顯影響。切脾或給予阿替美唑,或者迷走神經(jīng)切斷均可導(dǎo)致Dex的抗炎效應(yīng)消失。4.腎組織切片HE染色可觀察到r I/R導(dǎo)致廣泛急性腎小管擴張,腎小管上皮細胞扁平,核碎裂致未著色,組織病理學(xué)評分高。給予Dex或VNS可明顯改善腎臟的病理改變并降低組織病理學(xué)評分,而切脾、迷走神經(jīng)切斷或給予阿替美唑,均可導(dǎo)致Dex對腎臟組織的保護效應(yīng)消失。5.腎I/R可明顯增加TUNEL染色凋亡陽性細胞數(shù),并且通過定量分析,r I/R組陽性細胞率明顯高于對照組,而給予Dex或VNS可顯著降低凋亡細胞數(shù)。同樣地,給予迷走神經(jīng)切斷或阿替美唑,均可導(dǎo)致Dex細胞保護效應(yīng)消失,而切脾甚至加劇細胞凋亡。結(jié)論:1.Dex可直接增強迷走神經(jīng)放電頻率,從而增加血清ACh水平并降低CA水平。2.Dex可通過激活CAP降低r I/RI引起的血清炎癥介質(zhì)水平,從而提供腎保護效應(yīng)。3.Dex的抗炎作用有賴于迷走神經(jīng)環(huán)路的完整性。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 13：頸部正中切口；B：顯露頸部解剖；C：分離并剪斷胸乳突肌；D：顯露頸部血管及迷走神：鈍性分離神經(jīng)；F：游離神經(jīng)掛線備用；G：將神經(jīng)置于掛鉤；H：顯露腎及腎蒂；I：夾閉圖 1. C57BL／6J 小鼠頸部迷走神經(jīng)放電頻率采集及腎缺血再灌注模型制備2.1.1.3.2 小鼠血清及雙側(cè)腎臟標本收集（1）小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，固定于小動物顯微鏡手術(shù)臺上并消毒胸腹部皮巾，羅哌卡因腹部皮下浸潤麻醉。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： ；B：I/R；C：Dex+I/R；D：Atip+Dex+I/R。圖中 T 代表每 5min 一個時電頻率，紅色標記（D）代表給予 Dex；（I）代表缺血開始即刻；（R）代代表給予 Atip；* P<0.05 vs T2美托咪定對 C57BL/6J 小鼠頸部迷走神經(jīng)放電頻率的影響（各組 n=6-8，論膽堿能抗炎通路的研究當中，對迷走神經(jīng)放電頻率的檢測往往后再檢測其近心端（傳入纖維）或者是遠心端（傳出纖維）的病理情況下不同的干預(yù)措施對膽堿能抗炎通路的激活的影響[20電刺激也是采用該方法，，切斷迷走神經(jīng)后再刺激近心端（傳出模型的影響，這種方法可以分別明確迷走神經(jīng)放電傳入和傳出
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R614

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 馬劍波;黎娟娟;魯開智;顧健騰;;小鼠頸部迷走神經(jīng)放電采集方法在腎缺血再灌注實驗中的運用[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2017年03期

本文編號：2512852