發(fā)布時(shí)間：2019-05-01 06:46

【摘要】：近年來,乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率高,大多與抑癌基因發(fā)生基因突變密切相關(guān),從而導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是癌癥患者病情復(fù)發(fā)或者死亡的主要原因。傳統(tǒng)的用于檢測腫瘤的方法如血清腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)診斷對腫瘤發(fā)生早期的檢出率均較低,所以有效地檢測腫瘤早期的微小轉(zhuǎn)移一直是臨床醫(yī)學(xué)面臨的挑戰(zhàn)。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells, CTCs)是存在于很多腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞,它由原發(fā)灶脫落后進(jìn)入人體循環(huán)或淋巴系統(tǒng),并通過外周血轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端的組織或者器官甚至遍布全身。循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和一些腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性,所以在循環(huán)系統(tǒng)中能夠進(jìn)入血管、快速增殖并形成轉(zhuǎn)移瘤。很多研究都表明循環(huán)腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附等與癌癥的轉(zhuǎn)移和預(yù)后復(fù)發(fā)均有密切關(guān)系。所以,循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有很重要的臨床意義,對早期診斷、預(yù)后判斷、療效檢測和靶向藥物的開發(fā)等提供理論基礎(chǔ)。在全血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞數(shù)相比極少,對其進(jìn)行分離、檢測和純化仍具有一定的挑戰(zhàn)性。目前主要依據(jù)腫瘤細(xì)胞的大小、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞密度和腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的生物學(xué)特性對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離,包括過濾法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面電荷法和免疫磁珠法等。對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測主要從細(xì)胞計(jì)數(shù)和核酸表達(dá)分析兩個(gè)方面進(jìn)行。研究者一直致力于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、檢測和純化技術(shù)的研究,希望能夠找到高效捕獲腫瘤細(xì)胞的方法并將其應(yīng)用于臨床檢測。微流控芯片是近幾年飛速發(fā)展的一種對CTCs進(jìn)行快速檢測和操控的技術(shù)。它具有可控的單元集成模式和微尺度結(jié)構(gòu),可實(shí)現(xiàn)樣品處理、捕獲和檢測一體化,降低試劑和樣品量的消耗,能實(shí)現(xiàn)快速、高效、高通量的分析,獲得更多有關(guān)CTCs的信息。MUC1是一類高分子糖蛋白,正常細(xì)胞中低表達(dá),在癌細(xì)胞和癌組織中高表達(dá)并以畸形糖基化和糖基化不完全兩種形態(tài)存在,從而使抗原分布在癌細(xì)胞表面,可被特異性抗體識別。MUCl與腺癌特別是乳腺癌的癌細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān),其表達(dá)與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移也具有相關(guān)性。本研究利用微流控芯片作為載體,通過對芯片基底表面進(jìn)行MUCl抗體修飾,利用抗原與抗體相結(jié)合的方法,實(shí)現(xiàn)了對人乳腺腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231的特異性捕獲和研究。乳腺腫瘤細(xì)胞捕獲的條件和環(huán)境嚴(yán)重影響了癌細(xì)胞捕獲效率,因此篩選和優(yōu)化捕獲條件對于提高細(xì)胞捕獲率很有必要。實(shí)驗(yàn)中從微流控基底表面的粗糙度、微流控孔道的花紋、抗體孵育時(shí)間、細(xì)胞樣品注入流速、細(xì)胞注入芯片后在通道內(nèi)停滯的時(shí)間等方面進(jìn)行捕獲條件優(yōu)化,結(jié)果獲得了較高的細(xì)胞捕獲率。捕獲后的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)過分離和再培養(yǎng),進(jìn)一步利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)分別分析芯片捕獲是否影響乳腺癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平變化。同時(shí)對抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin)處理的正常和再培養(yǎng)的人類乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中AN1-、RUNX2、ITGA6 MMP3、LAMB3和ERBB2基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,利用微流控芯片能有效富集腫瘤細(xì)胞,捕獲前后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)無顯著差異,均能產(chǎn)生藥物敏感性；為微流控應(yīng)用于腫瘤的臨床檢測、診斷,腫瘤個(gè)性化治療方案的選擇及腫瘤藥物的篩選等提供研究基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：2469088