【摘要】：目的眾所周知,目前晚期肝硬化患者除肝移植外無較好的治療方法,但肝移植供體緊缺,配型復(fù)雜,等待周期長,移植費用高,極大的限制了肝移植的臨床應(yīng)用。隨著干細(xì)胞替代治療研究的興起,目前干細(xì)胞移植有望成為終末期肝病的有效治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)具有強大的分化能力能為許多終末期疾病帶來希望,是一種多能干細(xì)胞。具有提取方法簡單,低成本,低免疫性等特點。隨著研究的深入,越來越多的證據(jù)表明MSCs通過免疫調(diào)節(jié)或者分泌細(xì)胞因子的機制來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織修復(fù),從而發(fā)揮其主要的治療作用。本實驗采用內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)大鼠枯否細(xì)胞(kupffer cells,KCs)發(fā)生極化改變,之后用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hu MSCs)與LPS誘導(dǎo)的KCs在transwell內(nèi)共培養(yǎng),觀察hu MSCs對KCs極化偏移的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步來研究MSCs對炎癥免疫調(diào)節(jié)及其作用機制。方法采用膠原酶在體灌注和離體消化、密度梯度離心和選擇性貼壁法,并結(jié)合機械分離和振蕩孵育,最大程度的消化SD大鼠肝組織從而高效得到更多的原代KCs。經(jīng)過形態(tài)觀察,吞噬功能檢測,細(xì)胞表面標(biāo)志檢測等方法驗證細(xì)胞。成功取得KCs后,進(jìn)行培養(yǎng)。同時進(jìn)行hu MSCs細(xì)胞培養(yǎng),觀察,驗證。之后將KCs與MSCs在Transwell內(nèi)共培養(yǎng)。實驗分為KCs組(正常組),KCs細(xì)胞+LPS組(對照組),MSCs+KC+LPS組(實驗組)。實驗組用經(jīng)典的LPS刺激原代大鼠KCs發(fā)生極化后再與hu MSCs共培養(yǎng)18h,正常組加入等量DMEM培養(yǎng)基,對照組在LPS刺激后,加入DMEM培養(yǎng)基作為對照。觀察同一時間點各組的IL-4,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),IL-10,IL-6等上清因子變化,以上上清因子用ELISA法進(jìn)行檢測;用Westing-blot方法檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,i NOS),精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1),信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)STAT-3,STAT-6,核因子kappa B(nuclear factor-k B,NF-κB)。同時用q RT-PCR對以上結(jié)果進(jìn)行驗證。檢測結(jié)果采用統(tǒng)計學(xué)軟件分析,均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,F檢驗判斷兩樣本間的方差齊性,多組間差異檢驗采用單因素方差分析,t檢驗分析兩組間統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果對照組促炎因子TNF-α分泌增加,實驗組抑炎因子IL-10,IL-4分泌增加,而IL-6的分泌實驗組升高更明顯;而Western-blot檢測表明對照組中i NOS升高,NF-κBp65入核增高,而實驗組高表達(dá)Arg-1,同時p STAT-3,p STAT-6表達(dá)增加,NF-κBp65入核減少,但是NF-κBpp65核內(nèi)增多。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢測結(jié)果提示hu MSCs與枯否細(xì)胞極化后共培養(yǎng)后與對照組及空白組存在明顯差異。結(jié)論分析以上數(shù)據(jù)結(jié)果表明hu MSCs能誘導(dǎo)KCs向M2表型偏移,主要表現(xiàn)為抗炎因子分泌增加,Arg-1合成增加,考慮可能與hu MSCs分泌細(xì)胞因子有關(guān),起到一種免疫調(diào)節(jié)作用,hu MSCs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的分子機制可能與通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。該結(jié)論首次用不同種屬細(xì)胞共培養(yǎng)研究巨噬細(xì)胞極化問題,且采用原代大鼠枯否細(xì)胞,更具有研究意義。同時該實驗說明已經(jīng)極化的枯否細(xì)胞是可以發(fā)生M2極化改變,但M2極化的巨噬細(xì)胞來源有待進(jìn)一步驗證。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R657.3
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本文編號：2463353