【摘要】：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,是女性癌癥患者的重要致死原因。乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的關(guān)鍵所在。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)參與乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥等疾病過程,推動原位癌向侵襲性乳腺癌發(fā)展。G3BP1作為Ras的調(diào)節(jié)蛋白,能夠參與腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞增殖、運(yùn)動、侵襲和凋亡等多項(xiàng)生命活動。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),下敲G3BP1能抑制人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞的遷移和侵襲,提示G3BP1可能與EMT相關(guān)。本課題就G3BP1與EMT的相關(guān)性展開研究,并進(jìn)一步研究其分子作用機(jī)制。此外,我們還發(fā)現(xiàn)G3BP1能夠調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖,β-Catenin信號通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖活動,因此我們還初步探討了G3BP1對β-Catenin信號通路的調(diào)控作用及作用機(jī)制。目的：1、闡明G3BP1介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT過程。2、闡明G3BP1對Smad信號通路的調(diào)控作用及作用機(jī)制。3、驗(yàn)證G3BP1在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用,探討其作為新的乳腺癌轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物的可能性。4、初步探討G3BP1對P-Catenin信號通路的調(diào)控作用及作用機(jī)制。方法：1、檢測G3BP1是否參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT過程。首先構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)人源G3BP1的質(zhì)粒,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,構(gòu)建了G3BP1穩(wěn)定高表達(dá)的MDCK細(xì)胞系。在該模式細(xì)胞中,分別觀察了細(xì)胞形態(tài)的變化,運(yùn)用Western blot方法檢測了EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的變化,運(yùn)用免疫熒光方法檢測細(xì)胞骨架蛋白的變化情況,運(yùn)用Transwell遷移和Matrigel transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。接下來,我們在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中,分別采用瞬時／穩(wěn)定高表達(dá)和下敲G3BP1的方法,運(yùn)用相同方法檢測了G3BP1對EMT的調(diào)控作用。2、檢測調(diào)控EMT過程的Smad信號通路。在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中,運(yùn)用Western blot方法檢測瞬時／穩(wěn)定上調(diào)或下調(diào)G3BP1對Smad磷酸化水平的影響。運(yùn)用Real-time PCR方法,檢測該信號通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。采用CO-IP方法,檢測G3BP1與Smads的相互作用。采用干擾RNA技術(shù),尋找發(fā)揮調(diào)控EMT作用的轉(zhuǎn)錄因子和Smad蛋白。3、檢測G3BP1在乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中的作用。構(gòu)建4T1-luc G3BP1穩(wěn)定下敲細(xì)胞系,建立了小鼠體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。運(yùn)用活體動物成像技術(shù),檢測G3BP1下敲對乳腺癌原位瘤及轉(zhuǎn)移瘤的影響。運(yùn)用HE染色方法來觀察原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤的病理變化。并采用Western blot方法檢測原位瘤組織中EMT標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。4、檢測G3BP1對P-Catenin信號通路的調(diào)控作用。運(yùn)用SRB檢測方法,檢測上調(diào)或下調(diào)G3BP1的表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖的影響。采用Western blot方法檢測了β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白和靶基因的表達(dá)變化。運(yùn)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和β-Catenin核積累的變化指示該信號通路的活化情況。通過Western blot方法,檢測了G3BP1對GSK-3β磷酸化水平的影響以及GSK-3β激酶抑制劑對G3BP1表達(dá)水平的影響。采用CO-IP方法檢測G3BP1與GSK-3β的相互作用。結(jié)果：1、結(jié)果顯示,G3BP1高表達(dá)誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞發(fā)生EMT過程；G3BP1瞬時/穩(wěn)定高表達(dá)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMT過程；G3BP1瞬時/穩(wěn)定下敲抑制MDA-MB-231細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞表型。2、對調(diào)控EMT的Smad信號通路進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在MCF-7細(xì)胞中高表達(dá)G3BP1能夠促進(jìn)Smad信號通路的活化；在MDA-MB-231細(xì)胞中下敲G3BP1能夠抑制Smad信號通路的活化；該調(diào)控作用不依賴于外源性TGF-β1。CO-IP結(jié)果顯示,G3BP1與Smads特別是Smad2/4存在相互作用。下敲Slug幾乎能逆轉(zhuǎn)G3BP1介導(dǎo)的EMT過程；而下敲Smad3后,G3BP1幾乎不能發(fā)揮介導(dǎo)EMT過程的作用。3、G3BP1穩(wěn)定下敲能抑制4T1細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞特性。穩(wěn)定下敲G3BP1,能夠抑制4T1細(xì)胞在小鼠體內(nèi)形成原位瘤及轉(zhuǎn)移瘤。原位瘤中的細(xì)胞能夠保持G3BP1穩(wěn)定下敲的細(xì)胞特性。4、高表達(dá)G3BP1有促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖的趨勢,下調(diào)G3BP1的表達(dá)顯著抑制其增殖。高表達(dá)G3BP1能促進(jìn)β-Catenin信號通路活化,下敲則能抑制其活性。G3BP1能調(diào)控GSK-3β激酶的磷酸化,并與GSK-3β存在相互作用。GSK-3β特異性抑制劑SB216763能夠時間及濃度依賴性地下調(diào)G3BP1的表達(dá)水平。結(jié)論：1、在體外實(shí)驗(yàn)中,G3BP1能夠調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲；在小鼠體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中,G3BP1能調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)揭示了G3BP1在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的重要作用,提示G3BP1可作為一種潛在的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的靶標(biāo)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),G3BP1通過EMT過程實(shí)現(xiàn)對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控,G3BP1能通過Smads活化以及上調(diào)Slug轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT過程。本研究從分子和細(xì)胞水平揭示G3BP1調(diào)控EMT過程的作用機(jī)制。G3BP1能募集Smad2/4復(fù)合物,提示G3BP1有可能作為一種新發(fā)現(xiàn)的Smad輔助因子。2、G3BP1有可能通過調(diào)控GSK-3β激酶活性調(diào)控β-Catenin信號通路,通過該信號通路進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞增殖。該發(fā)現(xiàn)為G3BP1在乳腺癌增殖方面作用提供依據(jù)。GSK-3β特異性抑制劑SB216763促進(jìn)G3BP1的降解,提示其可能是一種新的G3BP1調(diào)控劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊劍鋒,陳森林,劉志紅,張蕓;乳腺癌組織中E-cadherin、β-catenin及cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性研究[J];癌癥;2004年07期

，

本文編號：2459701