【摘要】：研究背景乳腺癌和前列腺癌分別是女性和男性最常見的腫瘤類型,同時二者也分別占女性和男性因腫瘤死亡原因的第二位。惡性腫瘤細胞具有特殊的親骨性,使其易從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到骨微環(huán)境中,形成一繼發(fā)骨腫瘤病灶。80%以上的乳腺癌患者和90%以上的前列腺癌患者可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移可導致嚴重的骨痛、病理性骨折、致命性高鈣血癥及脊髓壓迫等骨相關(guān)事件(skeletal related events,SRE)。其中60%的患者可發(fā)生病理性骨折,20%的患者可發(fā)生高鈣血癥,而10%的患者可發(fā)生脊髓壓迫,這些均嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間。腫瘤骨轉(zhuǎn)移的本質(zhì)在于腫瘤細胞與骨髓內(nèi)多種細胞的相互作用。腫瘤細胞分泌甲狀旁腺相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHr P)等因子直接或間接作用于并調(diào)控成骨細胞或破骨細胞的分化及活性,而后骨基質(zhì)溶解及骨骼細胞可釋放轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等多種因子又進一步促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和血管發(fā)生等,形成所謂的“惡性循環(huán)”。目前臨床上已采用雙磷酸鹽、RANKL單抗等抗骨質(zhì)吸收的藥物用于腫瘤骨轉(zhuǎn)移的防治,可患者患者的骨痛等癥狀,但并不能提高患者的生存時間,臨床效果仍有待進一步的提高。臨床上根據(jù)病理學及放射學表現(xiàn),可將腫瘤骨轉(zhuǎn)移分為溶骨性、成骨性和混合性三種。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移通常為溶骨性,而前列腺癌骨轉(zhuǎn)移通常為成骨性。同時應(yīng)該注意的是,15%~25%的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者可發(fā)生成骨性骨損害。在骨微環(huán)境中,腫瘤細胞與成骨細胞、破骨細胞及基質(zhì)細胞等多種細胞相互作用,影響了正常的由成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收間的骨重建平衡。研究表明,腫瘤細胞可分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白、內(nèi)皮素1等因子促進新骨的形成。但腫瘤骨轉(zhuǎn)移的詳細分子機制仍存在許多不清楚的地方,進一步研究腫瘤骨損害的相關(guān)因子具有重要的現(xiàn)實意義。Sema 3A在正常生理狀態(tài)下對骨重建具有重要的影響。Hayashi等研究發(fā)現(xiàn),成骨細胞分泌的Sema 3A對成骨細胞和破骨細胞分化成熟具有雙向調(diào)節(jié)能力。Sema 3A通過與特異性受體NRP1結(jié)合,激活經(jīng)典wnt/β-catenin通路,促進β-catenin的核轉(zhuǎn)移,進而與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,增強成骨細胞的分化及其介導的骨形成。同時Sema 3A可抑制破骨前體細胞中plexina1-trem2-dap12復(fù)合體的形成,下調(diào)itam介導的共刺激通路和nfatc1的核表達,進而抑制破骨細胞的分化和其介導的骨吸收。目前sema3a在腫瘤成骨性骨轉(zhuǎn)移中的作用及潛在的機制仍不清楚。sema3a/nrp1信號通路是否參與成骨性骨轉(zhuǎn)移過程中成骨細胞和破骨細胞的分化成熟,還不得而知。本課題通過建立一個模擬腫瘤細胞調(diào)控成骨前體細胞、破骨前體細胞分化成熟的體外培養(yǎng)模型,深入研究sema3a在腫瘤介導的成骨性骨損害過程中的作用及具體分子機制。研究方法一、sema3a在不同骨轉(zhuǎn)移類型腫瘤細胞中表達的檢測實時熒光定量pcr、蛋白免疫印跡實驗、細胞免疫熒光等方法檢測sema3a在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7細胞系和前列腺癌細胞lncap、pc-3、c4-2的表達水平,篩選sema3a高表達細胞系。二、sema3a在成骨性腫瘤細胞介導的成骨分化過程中作用利用shrna慢病毒構(gòu)建sema3a低表達的乳腺癌和前列腺癌細胞系,或采用sema3a特異性中和抗體處理乳腺癌mcf-7和前列腺癌細胞c4-2,制備相應(yīng)的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium,cm),干預(yù)成骨前體細胞mc3t3-e1的成骨細胞分化,并進行如下檢測:1.利用堿性磷酸酶(alikalinephosphatase,alp)活性檢測和alp染色法檢測各組細胞alp活性。2.利用茜素紅s染色檢測各種細胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況。3.利用qpcr技術(shù)檢測各組細胞成骨標志基因alp、runx2、col1α1、ocn及osterix的相對表達量。4.利用蛋白印跡法檢測成骨前體細胞表面sema3a特異性受體nrp1的表達以及β-catenin的活化。三、sema3a在成骨性腫瘤細胞介導的破骨分化過程中作用利用小鼠單核細胞raw264.7和小鼠骨髓來源巨噬細胞(bonemarrow-derivedmacrophages,bmms)作為破骨前體細胞模型,同樣采用shrna慢病毒和中和抗體檢測sema3a在成骨性腫瘤細胞介導的破骨細胞分化過程中作用。主要的檢測方法:1.利用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,trap)染色檢測破骨細胞特異性分化情況。2.掃描電鏡檢測骨吸收陷窩形成情況。3.利用qpcr技術(shù)檢測破骨分化標志基因ck、trap及ctr的相對表達量。4.利用western-blot蛋白印跡法檢測raw264.7細胞表面nrp1的表達以及itam下游plc的活化。實驗結(jié)果一、sema3a在不同骨轉(zhuǎn)移類型腫瘤細胞中表達的檢測1.在成骨性乳腺癌mcf-7細胞中,sema3a的mrna和蛋白表達水平明顯高于溶骨性乳腺癌mda-mb-231細胞;2.在具有明顯促成骨能力的前列腺癌細胞c4-2細胞中,sema3a的mrna和蛋白表達水平明顯高于lncap和pc-3細胞。二、sema3a在成骨性腫瘤細胞介導的成骨分化過程中作用1.不同骨轉(zhuǎn)移類型乳腺癌細胞對成骨分化的調(diào)控作用alp活性及染色、ars染色及成骨標志基因的檢測提示:乳腺癌mcf-7細胞可明顯促進成骨細胞分化,而乳腺癌mda-mb-231細胞可明顯抑制成骨細胞分化。2.shrna慢病毒可有效建立穩(wěn)定的sema3a低表達mcf-7和c4-2細胞免疫印跡結(jié)果顯示,shrna慢病毒感染并經(jīng)嘌呤霉素篩選后,mcf-7和c4-2細胞中sema3a的mrna和蛋白表達水平均明顯下降,表明建立穩(wěn)定的sema3a低表達細胞系。3.sema3a參與乳腺癌mcf-7細胞介導的成骨分化作用sema3ashrna干擾可明顯抑制mcf-7細胞cm介導的促成骨分化作用,中和抗體的實驗也同樣驗證了這一結(jié)果。4.sema3a參與前列腺癌c4-2細胞介導的成骨分化作用alp活性及染色、ars染色及成骨標志基因的檢測提示:sema3ashrna干擾前列腺癌c4-2細胞sema3a的表達后,其腫瘤細胞cm介導的成骨細胞分化明顯受到抑制。5.腫瘤細胞來源的sema3a通過nrp1作用于成骨細胞,并促進wnt/β-catenin通路的活化shrna慢病毒干擾mcf-7細胞中sema3a的表達后,其對mc3t3-e1細胞上特異性受體nrp1的刺激作用明顯低于mcf-7cm組。mcf-7cm組和mcf-7nccm組可明顯促進成骨前體細胞細胞核中β-catenin的蛋白水平;干擾mcf-7細胞sema3a的表達后,細胞核中β-catenin的蛋白水平明顯降低,而胞漿中p-β-catenin的蛋白水平明顯升高。三、Sema3A在成骨性腫瘤細胞介導的破骨細胞分化過程中作用1.乳腺癌MCF-7細胞可促進RAW264.7細胞的破骨分化MCF-7細胞CM可明顯促進RAW264.7細胞CK、TRAP、CTR三個破骨分化標志基因的mRNA表達;TRAP染色結(jié)果也具有相同的趨勢。2.Sema 3A減弱MCF-7 CM介導的破骨細胞分化和骨吸收實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,干擾MCF-7細胞中Sema 3A的表達后,可進一步增強MCF-7細胞對RAW264.7細胞CK、TRAP表達的促進作用;TRAP染色結(jié)果顯示,干擾MCF-7細胞中Sema 3A的表達后,可進一步增強TRAP陽性多核細胞的數(shù)目;骨吸收陷窩SEM結(jié)果顯示,干擾MCF-7細胞中Sema 3A的表達后,可進一步增強MCF-7 CM介導的骨吸收。BMM的實驗結(jié)果具有相同的變化趨勢。3.Sema 3A促進破骨前體細胞NRP1的表達,抑制PLCγ的磷酸化水平抑制MCF-7細胞中Sema 3A的表達后,其對NRP1表達的促進作用明顯減弱。RAW264.7細胞中PLCγ的磷酸化水平與RANKL的誘導呈時間依賴關(guān)系。抑制MCF-7細胞中Sema 3A的表達后,PLCγ的磷酸化水平明顯增高。結(jié)論本實驗分析了不同骨轉(zhuǎn)移類型(成骨性、溶骨性和混合性)乳腺癌和前列腺癌細胞中Sema 3A這一作為骨代謝重要因子的表達情況,并探討其對腫瘤成骨性骨轉(zhuǎn)移病理過程中成骨細胞、破骨細胞分化和活性的調(diào)控作用。主要的結(jié)論如下:1成骨性骨轉(zhuǎn)移腫瘤細胞(MCF-7和C4-2)具有較高的Sema 3A表達水平,而溶骨性骨轉(zhuǎn)移腫瘤細胞(MDA-MB-231和PC-3)中Sema 3A的表達水平較低;2成骨性腫瘤細胞分泌的Sema 3A,可作用于成骨前體細胞上特異性受體NRP1,增強成骨前體細胞內(nèi)β-catenin的活性,促進成骨細胞的分化和其介導的骨形成。3腫瘤細胞來源的Sema 3A作用于破骨前體細胞上NRP1受體,抑制RANKL介導的ITAM共刺激通路和下游PLCγ的活化,進而抑制破骨細胞分化和骨吸收活性。綜上,腫瘤細胞來源的Sema 3A通過對骨微環(huán)境中成骨細胞和破骨細胞的雙向調(diào)控作用,其可能促進了腫瘤成骨性骨轉(zhuǎn)移的進展。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Graziana Colaianni;Giacomina Brunetti;Maria Felicia Faienza;Silvia Colucci;Maria Grano;;Osteoporosis and obesity: Role of Wnt pathway in human and murine models[J];World Journal of Orthopedics;2014年03期

2 湯昊;張征宇;;前列腺癌骨轉(zhuǎn)移研究進展[J];中華男科學雜志;2010年04期

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本文編號：2453149