【摘要】：目的:通過(guò)利用可活化穿膜肽的特性將熒光標(biāo)記物及磁共振對(duì)比劑帶入人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,借此研究肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞在膽管病中的變化,探討在肝膽管病中體外監(jiān)測(cè)膽管上皮細(xì)胞變化及藥物靶向定位的可行性,為臨床上治療膽管病以新的思路,提高膽管病的治療效果。方法:一、穿膜肽的合成及標(biāo)記:可活化穿膜肽(EEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRR-Ahx-k)由上海淘普生物科技有限公司利用用固相法化學(xué)合成,并在其N端分別標(biāo)記FITC及Gd-DTPA。二、熒光顯微鏡分析:培養(yǎng)正常人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(human intrahepatic bile ductepithelial cells,h IBDEC),培養(yǎng)成功后分別用含有2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)24h后再將每組分別用25umol?L-1、50umol?L-1、100umol?L-1、150umol?L-1標(biāo)記有FITC的ACPP(FITC-ACPP)孵育2h,觀察上訴各組細(xì)胞及無(wú)ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h組與無(wú)LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h組內(nèi)的熒光表達(dá)情況,選擇出LPS的刺激濃度范圍及最佳的FITC-ACPP作用濃度。三、流式細(xì)胞儀檢測(cè):(1)分別用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)h IBDEC72h,再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h。(2)用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)h IBDEC,按24h、48h、72h時(shí)間梯度培養(yǎng)后,再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h。(3)用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)h IBDEC72h,再將其與100umol?L-1的FITC-ACPP按照1h、2h、4h的時(shí)間梯度共孵育,采用流式胞儀檢測(cè)上訴各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值。四、磁共振成像研究:(1)分別用含有2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)h IBDEC72h,再將其與100umol?L-1的標(biāo)記有Gd-DTPA的ACPP(Gd-DTPA-ACPP)共孵育2h。(2)用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)h IBDEC,按24h、48h、72h時(shí)間梯度培養(yǎng)后,再將其與100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h。(3)用含有5μg/ml的LPS培養(yǎng)液培養(yǎng)h IBDEC72h,再將其與100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP按照1h、2h、4h的時(shí)間梯度共孵育,采用磁共振成像儀檢測(cè)上訴各組細(xì)胞及空白細(xì)胞組、無(wú)LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h組細(xì)胞內(nèi)的平均信號(hào)強(qiáng)度值。并采用視覺(jué)評(píng)價(jià)法分析各組細(xì)胞內(nèi)的磁共振信號(hào)變化特征。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。組與組間比較采用單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果:一、熒光顯微鏡檢測(cè)見(jiàn)無(wú)ACPP孵育有LPS刺激24h有FITC共孵育2h組及無(wú)LPS刺激有FITC-ACPP共孵育2h組細(xì)胞內(nèi)均未見(jiàn)熒光反應(yīng),其余各組均可見(jiàn)熒光反應(yīng)。同一FITC-ACPP濃度孵育及孵育時(shí)間、不同LPS刺激濃度的細(xì)胞相比,10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml組熒光肉眼觀無(wú)明顯差異。20μg/ml LPS刺激濃度下細(xì)胞不能貼壁,未到24h細(xì)胞碎裂死亡,15μg/ml LPS刺激濃度組雖未碎裂死亡,但僅有少量細(xì)胞存活,FITC-ACPP孵育后沖洗細(xì)胞爬片時(shí)細(xì)胞脫離載玻片,故20μg/ml與15μg/ml LPS刺激濃度組未能進(jìn)行熒光顯微鏡拍照;同一LPS刺激濃度、不同F(xiàn)ITC-ACPP濃度孵育的細(xì)胞相比,肉眼觀25umol?L-1與50umol?L-1組較100umol?L-1與150umol?L-1弱、100umol?L-1與150umol?L-1組無(wú)明顯差異,故選擇100umol?L-1的FITC-ACPP為實(shí)驗(yàn)濃度。二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)見(jiàn):(1)在5μg/ml LPS刺激濃度刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育的條件下,隨著FITC-ACPP孵育時(shí)間的增加(1h、2h、4h),平均熒光強(qiáng)度值逐漸增加,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)在5μg/ml LPS刺激濃度刺激、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育4h的條件下,隨著LPS刺激時(shí)間的增加(24h、48h、72h),平均熒光強(qiáng)度值逐漸增加,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)在不同濃度的LPS刺激72h、100umol?L-1的FITC-ACPP共孵育2h的條件下,隨著LPS濃度的增加(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml),平均熒光強(qiáng)度值雖有不同,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。三、磁共振成像研究示:(1)在5μg/ml LPS刺激濃度刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育的條件下,隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時(shí)間的增加(1h、2h、4h),平均磁共振信號(hào)強(qiáng)度值逐漸增加,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),視覺(jué)評(píng)價(jià)法亦能發(fā)現(xiàn)隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時(shí)間的增加,各組細(xì)胞間的磁共振信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。(2)在5μg/ml LPS刺激濃度刺激、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育4h的條件下,隨著LPS刺激時(shí)間的增加(24h、48h、72h),平均磁共振信號(hào)強(qiáng)度值逐漸增加,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),視覺(jué)評(píng)價(jià)法亦能發(fā)現(xiàn)隨著Gd-DTPA-ACPP孵育時(shí)間的增加,各組細(xì)胞間的磁共振信號(hào)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。(3)在不同濃度的LPS刺激72h、100umol?L-1的Gd-DTPA-ACPP共孵育2h的條件下,隨著LPS濃度的增加(2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml),平均磁共振信號(hào)強(qiáng)度值雖有不同,但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),視覺(jué)評(píng)價(jià)法亦未能發(fā)現(xiàn)差異。上訴各組細(xì)胞內(nèi)的磁共振信號(hào)強(qiáng)度值均較空白細(xì)胞組及無(wú)LPS刺激有Gd-DTPA-ACPP共孵育4h組強(qiáng),并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)結(jié)論:標(biāo)記有FITC及Gd-DTPA的ACPP具有靶向及高效的穿膜活性,其穿膜效率具有時(shí)間依賴性,且與一定濃度下的LPS對(duì)h IBDEC的刺激時(shí)間有關(guān),可用于病理狀態(tài)下的h IBDEC顯像。
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【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2439830